Eps15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate 15) homology domain containing proteins (EHDs) comprise a family of dynamin-related ATPases. The four mammalian members of this family (EHD1-4) are involved in various endocytic and membrane trafficking pathways. Structural studies revealed that EHDs assemble at the surface of membranes to form ring-like filaments. Assembly on membranes was shown to stimulate the ATPase activity. In case of EHD2, ring-like oligomers were proposed to stabilize the neck of caveolae, which in turn regulates cellular fatty acid uptake. The aim of this thesis was the identification of small molecule inhibitors that modulate EHD2 function and therefore cellular fatty acid uptake. Until now, there are no known inhibitors for EHD proteins. To this end, I optimized a malachite green-based ATPase assay to be robust and reproducible for a high-throughput setup. Drug screening was then employed to identify small molecules that inhibit the liposome-stimulated ATP hydrolysis of EHDs. Since EHD2 showed only a low ATPase activity, I initially screened for inhibitors against the closely related homologue EHD4. Validated hits were subsequently evaluated for inhibition against EHD2 in an HPLC-based setup. In this way, I identified chemical compounds that inhibited the ATPase activity of EHD4 and EHD2, and validated them in different biochemical assays. Interestingly, two of these small molecules were found to increase and decrease lipid droplet size in a cell-based assay. I also identified three inhibitors that were specific to EHD4 and did not interfere with the ATPase of EHD2 and the GTPase activity of Drp1, which was used as a control. Another exciting finding in this project were discovery of two compounds that accelerated the liposome-stimulated GTPase activity of Drp1. The identified inhibitors may have future applications to explore the function of EHDand Drp1-dependent cellular signaling pathways. Furthermore, they may be developed as therapeutic agents. Finally, my assay optimizations can be used to systematically and efficiently identify inhibitors for other dynamin superfamily members
Eps15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate 15) homology domain containing proteins (EHDs) umfassen eine Familie von Dynamin-verwandten ATPasen. Die vier Säugetiermitglieder dieser Familie (EHD1-4) sind in verschiedenen endozytischen- und Membran-Transportwegen beteiligt. Strukturelle Studien zeigten, dass sich EHDs an der Oberfläche von Membranen zu ringförmigen Filamenten zusammenlagern, wobei die Anordnung an Membranen die ATPase-Aktivität stimuliert. Im Fall von EHD2 wurden ringförmige Oligomere vorgeschlagen, die den Hals von Caveolae stabilisieren, was wiederum die zelluläre Fettsäureaufnahme reguliert. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung niedermolekularer Inhibitoren, die die EHD2-Funktion und damit die zelluläre Fettsäureaufnahme modulieren. Bisher sind keine Inhibitoren für EHD-Proteine bekannt. Zu diesem Zweck optimierte ich einen auf Malachitgrün-basierenden ATPase-Assay, um ihn robust und reproduzierbar für einen Hochdurchsatz-Screen zu machen. Anschließend wurde ein Inhibitorscreening durchgeführt, um kleine Moleküle zu identifizieren, die die Liposomen-stimulierte ATP-Hydrolyse von EHDs hemmen. Da EHD2 nur eine geringe ATPase-Aktivität zeigte, suchte ich zunächst nach Inhibitoren gegen das engverwandte Homolog EHD4. Validierte Hits wurden anschließend in einem HPLC-basierten Setup auf Hemmung gegen EHD2 ausgewertet. Auf diese Weise habe ich chemische Verbindungen identifiziert, die die ATPase-Aktivität von EHD4 und EHD2 hemmen, die ich in verschiedenen biochemischen Assays validiert habe. Interessanterweise wurde festgestellt, dass zwei dieser kleinen Moleküle in einem zellbasierten Assay Einfluss auf die Lipidtröpfchengröße haben, d.h. diese vergrößern oder verringern. Ich identifizierte auch drei Inhibitoren, die spezifisch für EHD4 waren und nicht die ATPase von EHD2 und die GTPase-Aktivität von Drp1 stören, welche als Kontrolle verwendet wurden. Eine aufregende Entdeckung in diesem Projekt waren zwei Verbindungen, die die Liposomen-stimulierte GTPase-Aktivität von Drp1 beschleunigten. Die identifizierten Inhibitoren können in zukünftigen Studien zur detaillierten Untersuchung der zellulären Funktion von EHD- und Drp1-abhängigen Signalwegen genutzt werden. Darüber hinaus können sie als Therapeutika weiter entwickelt werden. Letztendlich können meine Assay-Optimierungen auch verwendet werden, um Inhibitoren für andere Mitglieder der Dynamin-Superfamilie systematisch und effizient zu identifizieren.
