dc.contributor.author
Saif, Mohd
dc.date.accessioned
2023-09-20T08:37:46Z
dc.date.available
2023-09-20T08:37:46Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/40713
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-40434
dc.description.abstract
Eps15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate 15) homology domain
containing proteins (EHDs) comprise a family of dynamin-related ATPases. The four
mammalian members of this family (EHD1-4) are involved in various endocytic and
membrane trafficking pathways. Structural studies revealed that EHDs assemble at the
surface of membranes to form ring-like filaments. Assembly on membranes was shown
to stimulate the ATPase activity. In case of EHD2, ring-like oligomers were proposed
to stabilize the neck of caveolae, which in turn regulates cellular fatty acid uptake.
The aim of this thesis was the identification of small molecule inhibitors that modulate
EHD2 function and therefore cellular fatty acid uptake. Until now, there are no known
inhibitors for EHD proteins. To this end, I optimized a malachite green-based ATPase
assay to be robust and reproducible for a high-throughput setup. Drug screening was
then employed to identify small molecules that inhibit the liposome-stimulated ATP
hydrolysis of EHDs. Since EHD2 showed only a low ATPase activity, I initially screened
for inhibitors against the closely related homologue EHD4. Validated hits were
subsequently evaluated for inhibition against EHD2 in an HPLC-based setup. In this
way, I identified chemical compounds that inhibited the ATPase activity of EHD4 and
EHD2, and validated them in different biochemical assays. Interestingly, two of these
small molecules were found to increase and decrease lipid droplet size in a cell-based
assay. I also identified three inhibitors that were specific to EHD4 and did not interfere
with the ATPase of EHD2 and the GTPase activity of Drp1, which was used as a
control. Another exciting finding in this project were discovery of two compounds that
accelerated the liposome-stimulated GTPase activity of Drp1.
The identified inhibitors may have future applications to explore the function of EHDand
Drp1-dependent cellular signaling pathways. Furthermore, they may be developed
as therapeutic agents. Finally, my assay optimizations can be used to systematically
and efficiently identify inhibitors for other dynamin superfamily members
en
dc.description.abstract
Eps15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate 15) homology domain containing
proteins (EHDs) umfassen eine Familie von Dynamin-verwandten ATPasen. Die vier
Säugetiermitglieder dieser Familie (EHD1-4) sind in verschiedenen endozytischen- und
Membran-Transportwegen beteiligt. Strukturelle Studien zeigten, dass sich EHDs an der
Oberfläche von Membranen zu ringförmigen Filamenten zusammenlagern, wobei die
Anordnung an Membranen die ATPase-Aktivität stimuliert. Im Fall von EHD2 wurden
ringförmige Oligomere vorgeschlagen, die den Hals von Caveolae stabilisieren, was
wiederum die zelluläre Fettsäureaufnahme reguliert.
Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung niedermolekularer Inhibitoren, die die
EHD2-Funktion und damit die zelluläre Fettsäureaufnahme modulieren. Bisher sind keine
Inhibitoren für EHD-Proteine bekannt. Zu diesem Zweck optimierte ich einen auf
Malachitgrün-basierenden ATPase-Assay, um ihn robust und reproduzierbar für einen
Hochdurchsatz-Screen zu machen. Anschließend wurde ein Inhibitorscreening
durchgeführt, um kleine Moleküle zu identifizieren, die die Liposomen-stimulierte
ATP-Hydrolyse von EHDs hemmen. Da EHD2 nur eine geringe ATPase-Aktivität zeigte,
suchte ich zunächst nach Inhibitoren gegen das engverwandte Homolog EHD4. Validierte
Hits wurden anschließend in einem HPLC-basierten Setup auf Hemmung gegen EHD2
ausgewertet. Auf diese Weise habe ich chemische Verbindungen identifiziert, die die
ATPase-Aktivität von EHD4 und EHD2 hemmen, die ich in verschiedenen biochemischen
Assays validiert habe. Interessanterweise wurde festgestellt, dass zwei dieser kleinen
Moleküle in einem zellbasierten Assay Einfluss auf die Lipidtröpfchengröße haben, d.h.
diese vergrößern oder verringern. Ich identifizierte auch drei Inhibitoren, die spezifisch für
EHD4 waren und nicht die ATPase von EHD2 und die GTPase-Aktivität von Drp1 stören,
welche als Kontrolle verwendet wurden. Eine aufregende Entdeckung in diesem Projekt
waren zwei Verbindungen, die die Liposomen-stimulierte GTPase-Aktivität von Drp1
beschleunigten.
Die identifizierten Inhibitoren können in zukünftigen Studien zur detaillierten Untersuchung
der zellulären Funktion von EHD- und Drp1-abhängigen Signalwegen genutzt werden.
Darüber hinaus können sie als Therapeutika weiter entwickelt werden. Letztendlich
können meine Assay-Optimierungen auch verwendet werden, um Inhibitoren für andere
Mitglieder der Dynamin-Superfamilie systematisch und effizient zu identifizieren.
de
dc.format.extent
xii, 134 Seiten
dc.rights.uri
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject
Drug discovery
en
dc.subject
Enzyme kinetics
en
dc.subject
cellular asays
en
dc.subject.ddc
500 Natural sciences and mathematics::570 Life sciences::572 Biochemistry
dc.title
Discovery of small molecule modulators for Eps15 homology domain containing proteins
dc.contributor.gender
male
dc.contributor.firstReferee
Daumke, Oliver
dc.contributor.furtherReferee
Heinemann, Udo
dc.date.accepted
2023-01-19
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-refubium-40713-0
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access