Ein organotypisches dermoepidermales in vitro Modell aus bovinen Fibrozyten und Keratinozyten der Rinderklaue wurde basierend auf den Untersuchungen von NEBEL (2005) entwickelt, charakterisiert und experimentell eingesetzt. Enzymatische Zellisolierungsverfahren wurden an die besonderen Eigenschaften des Klauengewebes adaptiert, um die Kultivierung zu optimieren. Mit diesen Verfahren konnten Dermis und Epidermis zuverlässig und exakt voneinander getrennt werden, um im weiteren Verlauf möglichst reine Kulturen beider Zelltypen zu erhalten. Die isolierten Primärkulturen und daraus kultivierten Zelllinien wurden mittels morphologischer und immunhistochemischer Untersuchungstechniken charakterisiert. Kommerziell erhältliche Perfusionskammersysteme wurden derart modifiziert, dass die isolierten Zellen in den Kammern angezüchtet werden konnten. Da die kommerziellen Kammern technisch suboptimal waren, wurden eigene neue Kammersysteme entwickelt und für die Langzeitperfusionskultur verwendet. Anders als in statischen Kulturen wurde aufgezeigt, dass in einer Perfusionskammer die beiden Zelltypen schneller proliferierten, sich organspezifisch differenzierten und über Monate vital blieben. Es wurden Filtermaterialien gefunden, die als Biomembranen geeignet sind, um die Grundlage für das Wachstum der organotypischen Kulturen zu bilden. Mit den technisch optimierten Perfusionskammersystemen konnten Fibrozyten und Keratinozyten aus dem Klauengewebe erfolgreich dreidimensional angezüchtet werden. Die licht- und elektronenmikroskopischen sowie die immunhistochemischen Untersuchungen belegen, dass die räumliche Anordnung, also die Gewebearchitektur und die Differenzierung der Zellen der Situation in vivo weitgehend entsprachen; es konnten also organotypische Verhältnisse in vitro erreicht werden. Diese organotypischen Kulturen wurden experimentell eingesetzt, um ausgewählte Wachstumsfaktoren und Zytokine, die in der Pathogenese der Klauenrehe eine Rolle spielen sollen, zu untersuchen. Es wurden die Effekte von vier Faktoren (Keratinocyte growth factor, granulocyte macrophage-colony stimulating factor, interleukin 1-alpha und tumor necrosis factor-alpha) auf die Proliferation und Differenzierung der Horn bildenden Keratinozyten in vitro untersucht. Die Ergebnisse belegen, dass die Proliferation der Horn bildenden Zellen der Klaue durch diese Zytokine moduliert wird. Diese Faktoren sind damit sehr interessante Kandidaten für weiterführende Untersuchungen zur Pathophysiologie der Klauenrehe. Die in dieser Arbeit entwickelten und erprobten organotypischen Kulturen und Perfusionskammersysteme sind leistungsfähige Werkzeuge für weiterführende Arbeiten zur dermoepidermalen Interaktion in der Pathogenese der Klauenrehe und zum Studium beteiligter Pathomechanismen. Die Systeme und die Technologie bilden darüber hinaus eine Grundlage für die Bearbeitung entsprechender Fragestellungen bei andern Tierarten, also z.B. bei der Erforschung der an der Pathogenese der Hufrehe beteiligten Gewebeinteraktionen. Darüber hinaus sind diese Systeme eine Grundlage für die Untersuchung von Regulations- und Pathomechanismen in anderen Geweben/Organsystemen, wie z.B. der Haut oder der Placenta, in denen die dermoepidermale Kommunikation eine Rolle für den Erhalt der Gewebeintegrität und der Entwicklung von Erkrankungen spielt.
An organotypic dermoepidermal in vitro model of fibrocytes and keratinocytes isolated from the bovine hoof was developed basing on the investigations of NEBEL (2005). The model was characterised and challenged experimentally. Enzymatic methods for the isolation of cells were adapted to the specific properties of claw tissue in order to optimise the culture. Using these methods it was possible to separate dermis and epidermis precise and reproducible to obtain highly pure cultures of both cell types. The isolated primary cultures were characterised by means of morphological and immunohistochemical techniques. Commercial available perfusion chamber systems were modified in a way that is was possible to use them to culture the isolated hoof cells. As the commercial chambers were suboptimal, novel chambers were developed and used for long term perfusion culture of the cells. Different to static cultures it was shown that both cell types proliferated faster, subsequently differentiated in an organ specific way and stayed vital over months. Filter materials were identified and tested experimentally, which were suitable as bio membranes in the chambers. These membranes provided the basis for the organotypic growth of cells in the chamber. With the optimised perfusion chamber systems fibroblasts and keratinocytes deriving from claw tissue were cultured three dimensionally. Light and electron microscopic as well as immunohistochemical examination proof that the spatial arrangement, i.e. the tissue architecture and the differentiation of cells in vitro largely resembled the situation in vivo. The culture in perfusion chambers successfully simulated an in vivo situation in vitro. These organotypic cultures were used for a series of challenge experiments to examine the effects of selected growth factors and cytokines, which are believed to play a role during the pathogenesis of bovine laminitis. The effects of four factors (Keratinocyte growth factor, granulocyte macrophage-colony stimulating factor, interleukin 1-alpha and tumor necrosis factor-alpha) on cellular proliferation and differentiation were examined in vitro. The results provide evidence that the proliferation of the horn producing keratinocytes is modulated by these factors. Therefore these are promising candidates for continuative examinations on the physiopathology of bovine laminitis. The novel organotypic cultures and perfusion chambers developed and tested in the work presented here are powerful tools for future research on dermoepidermal interactions during the pathogenesis of bovine laminitis and on the mechanisms involved. Beyond this, the systems and the associated technology provide a basis for studying related problems in other species, e.g. laminitis in horse and its pathomechanisms. Furthermore, the systems presented here could provide the basis for investigation of the regulatory mechanisms in other tissues and organs, such as skin or placenta, were dermoepidermal regulation plays a role in maintenance of tissue integrity and development of disease.
