Release of neurotransmitters requires a fast-acting and very reliable protein machinery. At the same time it needs to be regulated for variable demands at different types of synapses. In my PhD study I investigated how different paralogs of two essential vesicular proteins influence release parameters at murine glutamatergic and GABAergic synapses. In the first part of my thesis I studied neurotransmitter release in absence of the v-SNARE synaptobrevin 2 and compared release properties of synaptobrevin 1 and 2. The core machinery of synaptic vesicle fusion consists of three SNARE proteins, the two t-SNAREs at the plasma membrane (SNAP-25, syntaxin 1), and the vesicle bound synaptobrevin 2 (VAMP2). Formation of the trans-oriented four-α-helix bundle between these SNAREs brings vesicle and plasma membrane in close proximity and prepares the vesicle for fusion. The t-SNAREs are thought to be necessary for vesicle fusion. Whether the v-SNAREs are required for fusion is still unclear, as substantial vesicle priming and spontaneous release activity remains in mammalian mass cultured synaptobrevin-deficient neurons. Using the autaptic culture system from synaptobrevin 2 knockout neurons of mouse hippocampus, I found that the majority of cells were devoid of any evoked or spontaneous release and had no measurable readily-releasable pool. A small subpopulation of neurons, however, displayed release, and their release activity correlated with the presence and amount of v-SNARE synaptobrevin 1 expressed. Comparison of synaptobrevin 1 and 2 in rescue experiments demonstrate that synaptobrevin 1 can substitute for the other v-SNARE, but with a lower efficiency in neurotransmitter release probability. Release activity in synaptobrevin 2-deficient mass cultured neurons was massively reduced by a knockdown of synaptobrevin 1, demonstrating that synaptobrevin 1 is responsible for the remaining release activity. These data support the hypothesis that both t- and v-SNAREs are absolutely required for vesicle priming and evoked release and that differential expression of SNARE paralogs can contribute to differential synaptic coding in the brain. This work has been published elsewhere (Zimmermann et al., 2014). In the second part of my thesis I analyzed if expression of the glutamate transporter VGLUT3 induces co-release of glutamate and GABA from striatal interneurons. Co-release of two or more classical neurotransmitters from the same neuron seems to be quite common throughout the nervous system. However, the co-release of glutamate and GABA – the two major excitatory and inhibitory neurotransmitters – has not been thoroughly analyzed on a vesicular level. I used a lentiviral construct to exogenously express VGLUT 3 in autaptic GABAergic neurons cultured from the striatum. Performing patch-clamp recordings I addressed the question whether GABA and glutamate can be released from the same vesicle by recording postsynaptic events. I found that action potentials in GABAergic neurons expressing VGLUT3 evoked mixed postsynaptic currents (PSC) mediated by both GABA and glutamate release. Using analysis of decay kinetics from miniature PSCs of spontaneous release, I determined that the quantal events underlying the evoked mixed PSC included vesicles containing both glutamate and GABA. I tested for synergistic effects of GABA loading when glutamate was present in the vesicle. Neurons expressing VGLUT3 did not exhibit an increase in vesicular GABA content, measured by the mPSC size in presence of NBQX. Glutamate release from GABAergic neurons did not alter the expression level of postsynaptic AMPA receptors, as exogenous kainate application evoked similar currents in control GABAergic cell and those expressing VGLUT3. Interestingly, synaptic input of “purely” glutamatergic neurons to striatal GABAergic neurons expressing VGLUT3 impeded detection of glutamate co-release, probably by drawing away AMPA receptors to glutamatergic synapses. The findings provide new insights into glutamate/GABA co-release and suggest that the neuronal network has a great influence on the detection of co-release.
Die Freisetzung von Neurotransmittern erfordert eine verlässlich und schnell arbeitende Proteinmaschinerie. Gleichzeitig muss der Prozess hoch regulierbar sein, um sich an die verschiedene Anforderungen der unterschiedlichen Synapsentypen anzupassen. In meiner Doktorarbeit erforschte ich, wie verschiedene Paraloge von zwei essentiellen vesikulären Proteinen die Freisetzungseigenschaften an glutamatergen und GABAergen Synapsen der Maus beeinflussen. Die Kernmaschinerie zur Verschmelzung von synaptischen Vesikeln mit der Plasmamembran besteht aus drei SNARE-Proteinen, den beiden t-SNAREs Syntaxin 1 und SNAP-25 in der Zellmembran und Synaptobrevin 2 (syb2), das in der Vesikelmembran verankert ist. Zur Fusion von Vesikel und Plasmamembran bilden die drei Proteine ein Vier-α-Helix-Bündel, das die beiden Membranen in direkte Nachbarschaft bringt und für die Freisetzung vorbereitet. Während die t-SNAREs absolut notwendig für die Verschmelzung von Vesikel mit Plasmamembran zu sein scheinen, ist die Situation bei v-SNAREs weniger klar. In Massenkulturen von Säugetierneuronen, bei denen syb2 genetisch ausgeschaltet wurde, konnte immer noch spontane Freisetzung und Vesikel-“Priming“ beobachtet werden. Im ersten Teil meiner Arbeit untersuchte ich Neurotransmitterfreisetzung in Abwesenheit des v-SNAREs syb2 und verglich Freisetzungsparameter zwischen Synaptobrevin 1 (syb1) und 2. Ich kultivierte Maus-Neurone, bei denen das Gen für syb2 ausgeschaltet war, im autaptischen Zellkultur-System und fand, dass die Mehrzahl der Zellen weder evozierte noch spontane Freisetzung zeigte und keinen messbaren Pool an Fusions-kompetenten Vesikeln aufwies. Allerdings konnte ich in einer kleinen Population von Neuronen Neurotransmitterfreisetzung nachweisen. Die Menge der Freisetzung korrelierte dabei mit der Proteinexpression eines anderen v-SNAREs, syb1. Ich verglich syb1 und -2 in Substitutions-Experimenten und fand, dass syb1 das andere v-SNARE ersetzen kann, aber eine geringere vesikuläre Freisetzungswahrscheinlichkeit verursacht. Die Freisetzung, die im syb2-Knockout in Massenkultur beobachtet wurde, konnte ich durch einen „Knockdown“ von syb1 stark reduzieren und damit zeigen, dass syb1 für die verbleibende Freisetzung verantwortlich ist. Meine Daten unterstützen die Hypothese, dass sowohl t-SNAREs als auch v-SNAREs absolut notwendig sind für sowohl Vesikel-“Priming“ als auch evozierte Freisetzung und dass die Expression verschiedener SNARE-Paraloge zur synaptischen Variabilität beiträgt. Im zweiten Teil meiner Arbeit analysierte ich, ob die Expression des Glutamattransporters VGLUT3 in striatalen Interneuronen die Ko-Freisetzung von Glutamat und GABA induziert. Die Ko-Freisetzung von zwei oder mehr klassischen Neurotransmittern aus demselben Neuron scheint sehr verbreitet zu sein in unserem Nervensystem. Allerdings wurde die Ko-Freisetzung von Glutamat und GABA – den wichtigsten exzitatorischen und inhibitorischen Neurotransmittern – bislang nicht gründlich auf vesikulärem Level untersucht. Ich nutzte eine lentivirale Fähre um VGLUT3 exogen in autaptischen GABAergen Neuronen aus dem Striatum zu exprimieren und fand heraus, dass die Aktionspotenziale dieser Nervenzellen eine gemischte postsynaptische Antwort (engl. postsynaptic current, PSC) aus einer GABA- und einer Glutamatkomponente aufwiesen. Durch die Auswertung der Kinetik von Miniatur-PSCs konnte ich zeigen, dass eine Gruppe von Vesikeln sowohl Glutamat als auch GABA enthielt. Die Anwesenheit von Glutamat führte nicht zu einer Erhöhung der GABA-Konzentration, was gegen synergistische Effekte der beiden Neurotransmitter spricht. Die Ko-Freisetzung von Glutamat führte auch nicht zu einer erhöhten Expression von AMPA- Rezeptoren in GABAergen Neuronen, was durch die Applikation von Kainat gezeigt werden konnte. Interessanterweise konnte Ko-Freisetzung von Glutamat und GABA in Massenkultur, wo „echte“ glutamaterge Synapsen um die vorhandenen Rezeptoren konkurrieren, nur sehr schlecht nachgewiesen werden. Die Erkenntnisse dieser Arbeit bieten neue Einsichten in die Ko-Freisetzung von Glutamat und GABA und legen nahe, dass die neuronale Umgebung großen Einfluss auf die Detektion von Ko-Freisetzung hat.
