A-kinase anchoring proteins (AKAP) tether the cAMP-dependent protein kinase (PKA) to subcellular structures in proximity to its substrates, providing the basis for compartmentalised cAMP signalling. In order to study the relevance of specific protein-protein interactions within compartmentalised cAMP signalling networks, it was aimed to establish small molecules disrupting AKAP-PKA interactions. An ELISA-based screening of a library containing 20,000 diverse, drug-like small molecules was conducted. Two of the identified hits inhibiting the AKAP18δ-PKA interaction concentration-dependently (FMP-API-1 and -2, IC50 values of 23 and 1 µM, respectively) were characterised. AKAP- mediated PKA-anchoring to AQP2-bearing vesicles is a prerequisite for the vasopressin-induced translocation of aquaporin (AQP2) into the plasma membrane of rat renal primary principal cells. Immunomicroscopic analysis revealed that FMP-API-2 (100 µM) completely, but reversibly inhibited the translocation. However, the AKAP-PKA interaction could not be confirmed as the target of FMP- API-2, which will have to be defined in future work. Disruption of AKAP-PKA interactions in cells was shown for FMP-API 1. cAMP-agarose pulldowns (enriching cAMP-binding proteins and their interaction partners) from compound-treated (100 µM) neonatal rat cardiac myocytes contained 60 % less coprecipitated AKAP18δ and AKAP150. β adrenoceptor-induced increases of L-type Ca2+-channel currents in cardiac myocytes, depending on the AKAP18α-PKA interaction, were abolished in presence of FMP-API 1. Biomolecular interaction analyses (by surface plasmon resonance; SPR) confirmed the inhibition of AKAP- PKA interactions through FMP-API-1 in vitro. In addition, SPR revealed direct binding of FMP-API-1 to PKA-RIIα subunits, which was confirmed by saturation transfer difference nuclear magnetic resonance (STD-NMR), a ligand-observed method to study protein-ligand interactions. The AKAP-derived peptide Ht31 binds to the docking and dimerisation (D/D) domain of RIIα, responsible for regulatory PKA-subunit dimerisation and AKAP-binding. SPR measurements showed additive binding of FMP-API-1 and Ht31 to RIIα, suggesting an allosteric binding mechanism for FMP-API-1. 1027, a chemical derivative of FMP-API-1, inhibits the AKAP-PKA interaction more effectively than FMP-API 1 while binding RIIα in the same fashion. By using RIIα deletion mutants, the binding region of 1027 was confined to amino acids 88-156 of RIIα. It includes the inhibitory motif (92-102), which binds to and inhibits catalytic PKA subunits. This provides a possible explanation for the observed 2.5-fold activity increase of recombinant PKA in presence of FMP-API 1. The activity of cellular PKA was also increased (1.5-fold) as measured by phosphorylation of a peptide substrate. As a consequence of PKA activation, the phosphorylation of phospholamban, an important PKA substrate in cardiac myocytes, was found to be 9-fold increased in the presence of FMP-API-1. β-adrenergic stimulation causes an increase in cAMP concentration in cardiac myocytes, which was enhanced by FMP-API-1 (shifting the EC50 from 724 nM to 95 nM). This is explained by disruption of the AKAP150-PKA interaction which is involved in a negative feedback loop limiting cAMP-synthesis by inhibition of adenylyl cyclase through PKA-phosphorylation. Taken together, the small molecule FMP-API-1 binds to PKA-RIIα subunits, inhibits AKAP-PKA-interactions in vitro and in cells by an allosteric mechanism and activates PKA. The dual action turns the molecule into a new tool to study compartmentalised cAMP signalling by interference with protein-protein interactions. Protein-protein interactions are involved in cellular signalling and are thus disease-relevant. Small molecules inhibiting such interactions were characterised in this work. They open new avenues in basic research as well as for future treatments of human diseases including water retention and heart failure.
A-Kinase Ankerproteine (AKAP) verankern die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) an subzellulären Strukturen in Substratnähe und bilden so die Grundlage für kompartimentierte cAMP-Signalwege. Um die Relevanz spezifischer Protein- Protein-Interaktionen in kompartimentierten cAMP-Signalnetzwerken zu analysieren, sollten kleine Moleküle für die Hemmung von AKAP-PKA- Interaktionen etabliert werden. Es wurde eine 20.000 wirkstoffähnliche kleine Moleküle umfassende Substanzbibliothek mittels eines ELISA-basierten Hochdurchsatzverfahrens durchmustert. Zwei der identifizierten Substanzen, die die AKAP-PKA-Interaktion konzentrationsabhängig hemmen (FMP-API-1 und 2, mit IC50-Werten von 23 µM bzw. 1 µM), wurden näher charakterisiert. Die AKAP- vermittelte PKA-Verankerung an AQP2-haltigen Vesikeln ist Voraussetzung für die Vasopressin-induzierte Umverteilung von Aquaporin-2 (AQP2) in die Plasmamembran renaler Ratten-Primärzellen. Immunfärbungen zeigten, dass FMP- API-2 (100 µM) die Umverteilung vollständig, aber reversibel hemmt. Allerdings konnte die AKAP-PKA-Interaktion nicht als Angriffspunkt von FMP-API-2 verifiziert werden. Dieser wird in zukünftigen Studien zu definieren sein. Die Hemmung von AKAP-PKA-Interaktionen durch FMP-API-1 wurde in Zellen bestätigt. cAMP-Agarose-Präzipitationen (zur Anreicherung cAMP-bindender Proteine und ihrer Interaktionspartner) aus FMP-API-1-behandelten (100 µM) neonatalen Rattenherzmyozyten enthielten 60 % weniger kopräzipitiertes AKAP18δ und AKAP150 im Vergleich zu Kontrollen. Der von der AKAP18α-PKA-Interaktion abhängige β Adrenozeptor-induzierte Anstieg von L-Typ-Ca2+-Kanalströmen in Herzmyozyten wurde durch FMP-API-1 verhindert. Biomolekulare Interaktionsanalysen (mittels Oberflächenplasmonresonanz; SPR) bestätigten die Hemmung von AKAP-PKA-Interaktionen durch FMP-API-1 in vitro. Außerdem zeigte SPR die direkte Bindung von FMP-API-1 an PKA-RIIα. Dies wurde durch Sättigungstransfer-Differenz (STD)-NMR bestätigt, eine Methode zur Analyse von Protein-Ligand-Interaktionen. Das AKAP-abgeleitete Peptid Ht31 bindet an die Docking- und Dimerisierungsdomäne (D/D) von RIIα, die für Dimerisierung und AKAP-Bindung regulatorischer PKA-Untereinheiten verantwortlich ist. SPR- Messungen zeigten additive Bindung von Ht31 und FMP-API-1 an RIIα, was einen allosterischen Bindungsmechanismus für FMP-API-1 nahelegt. Das kleine Molekül 1027, ein chemisches Derivat von FMP-API-1, hemmt die AKAP-PKA-Interaktion effektiver als FMP-API-1 und bindet wie dieses an RIIα. Mithilfe von RIIα- Deletionsmutanten wurde die Bindungsregion von 1027 auf die Aminosäuren 88-156 eingegrenzt. Diese beinhaltet das inhibitorische Motiv (92-102) von RIIα, welches die katalytische PKA-Untereinheit bindet und hemmt. Dies erklärt möglicherweise den beobachteten 2,5-fachen Aktivitätsanstieg rekombinanter PKA in Gegenwart von FMP-API-1. Die Aktivität zellulärer PKA wurde ebenfalls verstärkt (1,5-fach), wie durch Phosphorylierung eines Peptidsubstrats ermittelt wurde. Als Konsequenz der PKA-Aktivierung wurde eine 9-fache Verstärkung der Phosphorylierung von Phospholamban, eines wichtigen PKA- Substrats in Herzmyozyten, in Gegenwart von FMP-API-1 festgestellt. β-adrenerge Stimulation verursacht einen Anstieg der cAMP-Konzentration in Herzmyozyten, welcher durch FMP-API-1 verstärkt wurde (wobei sich der EC50-Wert von 724 auf 95 nM reduzierte). Dies kann durch die Inhibition der AKAP150-PKA-Interaktion erklärt werden. Sie ist an einer negativen Rückkopplungsschleife beteiligt, in der Adenylylzyklase durch PKA- Phosphorylierung gehemmt und damit die cAMP-Synthese begrenzt wird. Zusammengefasst bindet das kleine Molekül FMP-API-1 an PKA-RIIα- Untereinheiten, hemmt AKAP-PKA-Interaktionen in vitro und in Zellen mittels eines allosterischen Mechanismus und aktiviert PKA. Diese duale Wirkung macht das Molekül zu einem neuen Werkzeug für die Analyse kompartimentierter cAMP- Signalwege durch Hemmung von Protein-Protein-Interaktionen. Protein-Protein- Interaktionen sind an zellulären Signalwegen beteiligt und daher krankheitsrelevant. In dieser Arbeit wurden kleine Moleküle charakterisiert, die solche Interaktionen hemmen. Sie eröffnen neue Wege sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die zukünftige Behandlung menschlicher Krankheiten wie Wasserretention und Herzversagen.
