Die Präkonditionierung bezeichnet einen Mechanismus, bei dem die kurze Exposition eines Gewebes gegen eine Noxe zu einem toleranten Zustand gegen das schädigende Agens führt. Wir können eine frühe und eine späte Form unterscheiden, wobei die frühe Toleranz nach 5-120 min am ehesten durch Ionenkanal-, Rezeptor- und Proteinkinasemechanismen realisiert wird, während die späte Form nach 24-72h de novo Proteinsynthese benötigt. Es gibt Hinweise, dass dieses Phänomen auch beim Menschen existiert. Erythropoietin zeigte sich sowohl im Tiermodell als auch in klinischen Studien der Phase I und II als aussichtsreicher Kandidat. Bereits seit vor mehr als 10 Jahren wurde (HIF-1) als zentraler Bestandteil der Hypoxie vermittelten Signalkaskade identifiziert. Unsere Arbeitsgruppe postuliert, dass ein präkonditionierender Stimulus, wie z.B. Hypoxie oder DFX über HIF-1 eine Erythropoietininduktion zu vermitteln. Ziel meiner Arbeit war es diese Expression sowohl in der Zellkultur als auch im Tiermodell auf der mRNA-Ebene nachzuweisen. Der Nachweis des Erythropoietingens in neuronalen Geweben stellte eine besondere Herausforderung dar, da es sich durch eine sehr geringe Abundance auszeichnet. Ich habe zwei PCR-basierte Methoden zum Nachweis der Erythropoietin-mRNA- Expression etabliert, um anschließend zu untersuchen, ob präkonditionierende Stimuli eine erhöhte Expression der Erythropoietin-mRNA im Tiermodell bzw. der Zellkultur induzieren. Während ich zunächst eine semiquantitative RT-PCR etabliert habe, wurde eine ebenfalls exakte und sensitive 2. Methode mit der Real Time PCR realisiert. Diese Methode ist zwar technisch einfacher, Amplifikation und Detektion können in einem Schritt durchgeführt werden, allerdings war sie zu Beginn meiner Arbeit noch kein Standard. Es wurden Ratten durch DFX, bzw. Mäuse hypoxisch präkonditioniert. Die Experimente wurden außerdem mit hypoxisch präkonditionierten Astrozytenkulturen durchgeführt. Nach Isolierung der RNA wurde diese mit Hilfe von reversen Transkriptasen in die komplementäre cDNA umgeschrieben und auf die Expression des Zielgens Erythropoietin untersucht. Die Quantifizierung dieses Gens erfolgte einerseits durch die semiquantitative kompetitive RT-PCR, andererseits wurde die Genregulation durch die quantitative Real Time RT-PCR, basierend auf der Light Cycler Technology, untersucht. Die Normierung beider Verfahren erfolgte mit Hilfe eines konstitutiv exprimierten Gens, eines sogenannten Housekeeping Gens (β-Actin). Es zeigte sich in der vorliegenden Arbeit, dass sowohl Hypoxie als auch Desferrioxamin das Zielgen Erythropoietin in unterschiedlichem Maße induziert. Während sich eine bis zu fünffache Induktion des Gens durch DFX-Applikation nachweisen ließ, fand sich eine bis zu siebenfache Induktion nach hypoxischer Präkonditionierung. Nach Bindung von Erythropoietin an einem Typ 1 Zytokinrezeptor kommt es über die Phosphorylisation von verschiedenen Proteinen und dem Rezeptor selbst zur Aktivierung verschiedener intrazellulärer Pfade, es werden in Folge zahlreiche neuroprotektive Effekte wie die Antiapoptose, die Antioxidation, neurotrophe Effekte und die Angiogenese vermittelt. Tierexperimentell gewonnene Daten, die eine Protektion durch Erythropoietin nachweisen, lassen sich nicht ohne weiteres auf den Menschen übertragen. Auch wenn klinische Studien der Phase I und II diesbezüglich aussichtsreich erscheinen, erfordert es weitere Untersuchungen, um die klinische Wirksamkeit von Erythropoietin zu belegen. Auch die neuroprotektive Wirkung von Substanzen, die die endogene Erythropoietinbildung stimulieren, wie z.B. DFX, ist nur im Ansatz untersucht. Es bedarf weiterer Studien, um das auch klinisch aussichtsreiche Phänomen der Präkonditionierung besser verstehen und im klinischen Alltag therapeutisch ausnutzen zu können.
Preconditioning is defined as a mechanism where a tissue achieves a protected state by a subliminal exposure to a noxious stimulus. We can differentiate between early and delayed tolerance. Early tolerance occurred after 5-120 minutes and is very likely ion channel, protein kinase or receptor mediated. Delayed preconditioning sets in after a latency of about 24-72 hours and involves de novo protein synthesis. Some studies indicate that ischemic tolerance may also exist in humans. Erythropoietin is neuroprotective in vitro and in vivo models of cerebral ischemia. Clinical phase I and phase II trials suggest a beneficial effect of erythropoietin in the therapy of acute stroke. More than 10 years ago HIF-1 (Hypoxia-inducible factor) was identified as the master switch of the transcriptional response to hypoxia. Our study group hypothesizes that a preconditioning trigger like hypoxia, desferrioxamin or HIF-1 initiates the transcriptional activation of erythropoietin. The aim of my studies was to prove the transcription of Erythropoietin-mRNA in an in vitro and in vivo model of preconditioning. The detection of erythropoietin in neural tissues is difficult because of a very low abundance of this gene. I first established two PCR-based methods to demonstrate the Erhythropoietin- mRNA expression and than studied the expression of erythropoietin via preconditioning stimuli in an animal and cell culture model. First I established a semiquantitative competitive RT-PCR, while the second sensitive method was realized as a Real Time PCR. Whereas this method is easier to handle - amplification and detection is performed in one step - this method was not yet standard when I started my experiments. I examined rats pretreated with desferrioxamine and mice preconditioned by hypoxia as well as astroglial cell cultures treated by OGD (oxygen glucose deprivation). Total RNA was isolated and reverse transcribed into cDNA. The transcriptional regulation of erythropoietin was measured by a semiquantitative competitive polmerase chain reaction and also with a quantitative Real Time PCR based on the Light Cycler Technology. RNA preparation and reverse transcription was normalised on the basis of its β-Actin mRNA content, which is a Housekeeping Gene. It was possible to show that both hypoxia and desferrioxamin robustly induced transcription of erythropoietin. I revealed a 5-fold induction of the gene after desferrioxamine application, whereas a 7-fold induction by hypoxic preconditioning was proved. Erythropoietin activates a type 1 cytokine receptor and, subsequently, by an autophosphorylisation of the receptor and phosphorylisation of an associated tyrosine kinase, which activates different intracellular pathways. Thereby Erythropoietin mediates neuroprotective effects like antiapoptosis, antioxidation, angiogenesis and neurotrophic effects. The results of animal experiments cannot simply be transferred to human stroke therapy. Despite promising clinical phase I and II trials, we have to gather more data to confirm the clinical efficacy of erythropoietin. Also the neuroprotective effects of drugs, that stimulate endogenous erythropoietinproduction, such as desferrioxamine, have not been examined to any extent. Further investigations are needed, to reveal the clinical implications of preconditioning and to provide new therapeutic options for this phenomenon.