dc.contributor.author
Hufnagel, Maria
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:13:17Z
dc.date.available
2009-02-11T08:36:43.065Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/3565
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-7765
dc.description.abstract
Die Präkonditionierung bezeichnet einen Mechanismus, bei dem die kurze
Exposition eines Gewebes gegen eine Noxe zu einem toleranten Zustand gegen das
schädigende Agens führt. Wir können eine frühe und eine späte Form
unterscheiden, wobei die frühe Toleranz nach 5-120 min am ehesten durch
Ionenkanal-, Rezeptor- und Proteinkinasemechanismen realisiert wird, während
die späte Form nach 24-72h de novo Proteinsynthese benötigt. Es gibt Hinweise,
dass dieses Phänomen auch beim Menschen existiert. Erythropoietin zeigte sich
sowohl im Tiermodell als auch in klinischen Studien der Phase I und II als
aussichtsreicher Kandidat. Bereits seit vor mehr als 10 Jahren wurde (HIF-1)
als zentraler Bestandteil der Hypoxie vermittelten Signalkaskade
identifiziert. Unsere Arbeitsgruppe postuliert, dass ein präkonditionierender
Stimulus, wie z.B. Hypoxie oder DFX über HIF-1 eine Erythropoietininduktion zu
vermitteln. Ziel meiner Arbeit war es diese Expression sowohl in der
Zellkultur als auch im Tiermodell auf der mRNA-Ebene nachzuweisen. Der
Nachweis des Erythropoietingens in neuronalen Geweben stellte eine besondere
Herausforderung dar, da es sich durch eine sehr geringe Abundance auszeichnet.
Ich habe zwei PCR-basierte Methoden zum Nachweis der Erythropoietin-mRNA-
Expression etabliert, um anschließend zu untersuchen, ob präkonditionierende
Stimuli eine erhöhte Expression der Erythropoietin-mRNA im Tiermodell bzw. der
Zellkultur induzieren. Während ich zunächst eine semiquantitative RT-PCR
etabliert habe, wurde eine ebenfalls exakte und sensitive 2. Methode mit der
Real Time PCR realisiert. Diese Methode ist zwar technisch einfacher,
Amplifikation und Detektion können in einem Schritt durchgeführt werden,
allerdings war sie zu Beginn meiner Arbeit noch kein Standard. Es wurden
Ratten durch DFX, bzw. Mäuse hypoxisch präkonditioniert. Die Experimente
wurden außerdem mit hypoxisch präkonditionierten Astrozytenkulturen
durchgeführt. Nach Isolierung der RNA wurde diese mit Hilfe von reversen
Transkriptasen in die komplementäre cDNA umgeschrieben und auf die Expression
des Zielgens Erythropoietin untersucht. Die Quantifizierung dieses Gens
erfolgte einerseits durch die semiquantitative kompetitive RT-PCR,
andererseits wurde die Genregulation durch die quantitative Real Time RT-PCR,
basierend auf der Light Cycler Technology, untersucht. Die Normierung beider
Verfahren erfolgte mit Hilfe eines konstitutiv exprimierten Gens, eines
sogenannten Housekeeping Gens (β-Actin). Es zeigte sich in der vorliegenden
Arbeit, dass sowohl Hypoxie als auch Desferrioxamin das Zielgen Erythropoietin
in unterschiedlichem Maße induziert. Während sich eine bis zu fünffache
Induktion des Gens durch DFX-Applikation nachweisen ließ, fand sich eine bis
zu siebenfache Induktion nach hypoxischer Präkonditionierung. Nach Bindung von
Erythropoietin an einem Typ 1 Zytokinrezeptor kommt es über die
Phosphorylisation von verschiedenen Proteinen und dem Rezeptor selbst zur
Aktivierung verschiedener intrazellulärer Pfade, es werden in Folge zahlreiche
neuroprotektive Effekte wie die Antiapoptose, die Antioxidation, neurotrophe
Effekte und die Angiogenese vermittelt. Tierexperimentell gewonnene Daten, die
eine Protektion durch Erythropoietin nachweisen, lassen sich nicht ohne
weiteres auf den Menschen übertragen. Auch wenn klinische Studien der Phase I
und II diesbezüglich aussichtsreich erscheinen, erfordert es weitere
Untersuchungen, um die klinische Wirksamkeit von Erythropoietin zu belegen.
Auch die neuroprotektive Wirkung von Substanzen, die die endogene
Erythropoietinbildung stimulieren, wie z.B. DFX, ist nur im Ansatz untersucht.
Es bedarf weiterer Studien, um das auch klinisch aussichtsreiche Phänomen der
Präkonditionierung besser verstehen und im klinischen Alltag therapeutisch
ausnutzen zu können.
de
dc.description.abstract
Preconditioning is defined as a mechanism where a tissue achieves a protected
state by a subliminal exposure to a noxious stimulus. We can differentiate
between early and delayed tolerance. Early tolerance occurred after 5-120
minutes and is very likely ion channel, protein kinase or receptor mediated.
Delayed preconditioning sets in after a latency of about 24-72 hours and
involves de novo protein synthesis. Some studies indicate that ischemic
tolerance may also exist in humans. Erythropoietin is neuroprotective in vitro
and in vivo models of cerebral ischemia. Clinical phase I and phase II trials
suggest a beneficial effect of erythropoietin in the therapy of acute stroke.
More than 10 years ago HIF-1 (Hypoxia-inducible factor) was identified as the
master switch of the transcriptional response to hypoxia. Our study group
hypothesizes that a preconditioning trigger like hypoxia, desferrioxamin or
HIF-1 initiates the transcriptional activation of erythropoietin. The aim of
my studies was to prove the transcription of Erythropoietin-mRNA in an in
vitro and in vivo model of preconditioning. The detection of erythropoietin in
neural tissues is difficult because of a very low abundance of this gene. I
first established two PCR-based methods to demonstrate the Erhythropoietin-
mRNA expression and than studied the expression of erythropoietin via
preconditioning stimuli in an animal and cell culture model. First I
established a semiquantitative competitive RT-PCR, while the second sensitive
method was realized as a Real Time PCR. Whereas this method is easier to
handle - amplification and detection is performed in one step - this method
was not yet standard when I started my experiments. I examined rats pretreated
with desferrioxamine and mice preconditioned by hypoxia as well as astroglial
cell cultures treated by OGD (oxygen glucose deprivation). Total RNA was
isolated and reverse transcribed into cDNA. The transcriptional regulation of
erythropoietin was measured by a semiquantitative competitive polmerase chain
reaction and also with a quantitative Real Time PCR based on the Light Cycler
Technology. RNA preparation and reverse transcription was normalised on the
basis of its β-Actin mRNA content, which is a Housekeeping Gene. It was
possible to show that both hypoxia and desferrioxamin robustly induced
transcription of erythropoietin. I revealed a 5-fold induction of the gene
after desferrioxamine application, whereas a 7-fold induction by hypoxic
preconditioning was proved. Erythropoietin activates a type 1 cytokine
receptor and, subsequently, by an autophosphorylisation of the receptor and
phosphorylisation of an associated tyrosine kinase, which activates different
intracellular pathways. Thereby Erythropoietin mediates neuroprotective
effects like antiapoptosis, antioxidation, angiogenesis and neurotrophic
effects. The results of animal experiments cannot simply be transferred to
human stroke therapy. Despite promising clinical phase I and II trials, we
have to gather more data to confirm the clinical efficacy of erythropoietin.
Also the neuroprotective effects of drugs, that stimulate endogenous
erythropoietinproduction, such as desferrioxamine, have not been examined to
any extent. Further investigations are needed, to reveal the clinical
implications of preconditioning and to provide new therapeutic options for
this phenomenon.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Preconditioning
dc.subject
Erythropoietin
dc.subject
Desferrioxamin
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Genexpression von Erythropoietin durch Präkonditionierung des
Zentralnervensystems
dc.contributor.contact
mariamessig@web.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. med. A. Meisel
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. H. H. Marti
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. rer. nat. R. Schäfer
dc.date.accepted
2009-03-27
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000008251-3
dc.title.translated
Gene Expression of Erythropoietin by Preconditioning of the Central Nervous
System
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000008251
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000011362
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access