Ziel dieser Arbeit war es zunächst, die Sensitivität zum Nachweis von PrPSc/PrP 27-30, dem biochemischen Marker für TSE-Erreger, im Western Blot zu erhöhen. Die Sensitivität konnte dabei durch technische Optimierungen um das ca. 200fache gesteigert werden und erlaubte schließlich einen Nachweis des Proteins noch aus 6*10-6 g Hirnhomogenat aus Scrapie-Hamstern. Durch neue Aufschlussverfahren, in die ein spezieller Collagenase-Verdau-Schritt eingeführt wurde, gelang ein direkter Nachweis von PrPSc/PrP 27-30 aus Darmgewebe im Western Blot. Mit Hilfe der in dieser Arbeit verbesserten Aufschluss- und Western Blot-Verfahren wurden die Voraussetzungen dafür geschaffen, PrPSc/PrP 27-30 bei oral infizierten Versuchstieren in den Muskeln bereits im präklinischen Stadium nachweisen zu können (Thomzig et al, 2003, 2004b, 2006). Neben den genannten methodischen Fortschritten ist es im Rahmen dieser Arbeit gelungen zu zeigen, dass eine Rektumbiopsie zur Diagnosesicherung einer Scrapie-Erkrankung an lebenden Modelltieren (Hamster) genutzt werden kann. Es stellte sich allerdings heraus, dass diese digmatische Möglichkeit erst im terminalen Stadium der Erkrankung besteht, da zu früheren Zeitpunkten die Menge an PrPSc/PrP 27-30, die im Rektum abgelagert ist, für einen bioptischen Nachweis zu gering ist. Insofern ergab sich aus den Befunden kein wesentlicher Vorteil für eine frühzeitige in vivo Diagnose gegenüber bisher bekannten Diagnosemethoden. Für die Untersuchungen der Ausscheidungskinetik von PrPSc in Fäzes wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Verfahren entwickelt, das erstmals den direkten Nachweis von PrPSc/PrP 27-30 im Kot ermöglichte. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine Ausscheidung von PrPSc 1-2 Tage nach der Verfütterung des Erregers, aber danach nicht mehr auftritt. Im Gegensatz zu anderen Untersuchungen, in denen allein die Auswirkungen des Kontaktes mit möglicherweise erregerhaltigem Material beobachtet wurden (Miller et al., 2004), konnte mit unserem Verfahren eine wesentlich exaktere Abschätzung des Risikos einer Übertragung mittels der Fäzes getroffen werden. Sofern die Befunde im Hamstermodell einen Vorhersagewert bei natürlichen Wirten wie Schafen haben, erscheint eine oral- fäkale Übertragung von Scrapie bei diesen Tieren nicht sehr wahrscheinlich, bzw. höchst untergeordneter epidemiologischer Bedeutung. Die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen zur Lokalisation von PrPSc in der Darmwand bestätigten in der Literatur beschriebene Beobachtungen und lieferten präzisierende Erkenntnisse, wo das pathologische Prion-Protein intestinal abgelagert wird. Die identifizierte PrPSc-Lokalisation vorwiegend unterhalb des mucosalen Epithels, und insofern relativ großer Distanz zum Darmlumen bietet einen plausiblen Erklärungsansatz dafür, weshalb kein, oder zumindest nur unnachweisbar wenig PrPSc aus der Darmwand in die Fäzes gelangt.
First of all, the aim of this study was to improve the sensitivity for the detection of PrPSc/PrP27-30, the biochemical marker for TSE-agents by Western- blotting. During this work it was possible by technical optimization of this method to increase the sensitivity by a factor of 200 fold allowing the detection of PrPSc from at least 6x10-6 g brain homogenate from terminally ill scrapie hamsters. By using new purification methods and introducing a collagenase-A digestion step it was possible to detect PrPSc/PrP27-30 also from gut tissue by Western-Blot analysis. Subsequently by means of these improved purification and Western-blot methods the detection of PrPSc/PrP27-30 in muscles of orally infected hamsters could be achieved already from animals from the preclinical phase of scrapie. Besides the described technical advances it could be shown in this thesis that rectum biopsies can be used as a practical tool for TSE-diagnosis in living animals. However, this was only applicable in the terminal stage disease, since the amount of PrPSc in the rectum is in earlier stages not high enough for Western-blot detection. Hence, so far there is no significant advantage in comparison to other methods for an in vivo diagnosis of scrapie. Furthermore, in this work a new PrPSc extracting method from faeces was established, facilitating a direct PrPSc detection in this tissue. By using the new method it could be shown that only 1-2 days after oral infection PrPSc is present in faeces. However, in samples from later time-points no PrPSc is detectable. In contrast to earlier reports, where only the impact of a contact with possibly prion contaminated materials have been studied (Miller et al., 2004), in this work a more precise estimation for the risk of a transmission via faeces could be achieved. Provided that the results in this study gained from a hamster model could be mirrored to natural hosts like sheep und deer, there is no justified evidence for an oral-faecal transmission of scrapie or chronic wasting disease in these animals. The results from the in this work performed immunohistochemical examinations regarding the location of PrPSc within the gut wall are in good accordance with already published data and provide a spatial precise detection of the pathological prion protein in the small intestine. The intestinal PrPSc accumulation is localized predominantly apical in the mucosal epithelium with a relatively large distance to the epithelial cells of the gut lumen. By this observation it could be explained why no or only undetectable amounts of PrPSc from the gut wall are excrited together with the faeces.
