Zielsetzung: Das Ziel dieser Arbeit war die Identifikation der molekularen Ursache einer angeborenen Erkrankung zweier Patientinnen. Die beiden Schwestern entstammen einer konsanguinen Ehe und präsentierten sich mit Makrozephalie, Gesichtsdysmorphie, psychomotorischer Retardierung und epileptischen Anfällen. Methodik: Wir vermuteten einen rezessiv vererbten Gendefekt als Ursache der Krankheit und nutzten eine Gesamtexomsequenzierung zur Entschlüsselung der DNA-Sequenz der Patientinnen. Um die Anzahl der vielen gefundenen DNA Varianten auf einige wenige, möglicherweise krankheitsverursachende Kandidaten zu reduzieren, kamen mehrere Filterschritte und eine Autozygotiekartierung zum Einsatz. Anschließend analysierte ich die verbliebenen Varianten unter Berücksichtigung der Art der Variante, der Funktion des betroffenen Gens, sowie einer eventuellen Assoziation zum Phänotyp der Patientinnen. Die letztendlich verbliebene Variante wurde experimentell untersucht hinsichtlich der Menge sowie der subzellulären Lokalisierung des kodierten Proteins in Fibroblasten einer Patientin im Vergleich zu gesunden Kontrollen. Funktionelle Assays in Patientenzellen gewährten zusätzliche Einblicke in den möglichen Pathomechanismus, der auf eine gestörte Regulation von Autophagie und Wachstum / Proliferation hindeutet. Ergebnisse: Die Gesamtexomsequenzierung legte eine bislang nicht beschriebene, homozygote missense Mutation im C-terminalen Teil des HERC1 Gens offen [chr15:g63,907,989C>G GRCh37.p11 | c.14,072G>C NM_003922 | p.(Arg4,691Pro)]. HERC1 ist ein großes Protein mit Ubiquitin-Ligasefunktion und funktioniert als Regulator des mTOR Signalwegs durch seine Interaktion mit TSC2. mTOR ist ein zentraler Signalknotenpunkt und reguliert abhängig vom Nährstoff- und Energiestatus sowie weiteren intra- und extrazellulären Einflüssen die feine Balance zwischen Zellkatabolismus und -anabolismus. Von mir durchgeführte funktionelle Analysen zeigten in Patientenfibroblasten unter katabolen Umständen eine abnorm hohe mTOR-Aktivität im Vergleich zu Kontrollen. Autophagie hingegen war in Patientenfibroblasten weniger aktiv als erwartet. Zusammenfassung: Aus der Literatur sind (mutmaßliche) loss-of-function Mutationen in HERC1 bei Patienten mit Makrozephalie, Gesichtsdysmorphie und psychomotorischer Retardierung bekannt. Dieser Symptomkomplex wird als MDFPMR Syndrom bezeichnet (OMIM #617011). Ich schließe aus meinen Versuchsergebnissen, dass die hier gefundene HERC1 missense Mutation zu einem Funktionsgewinn des kodierten Proteins führt, mit in der Folge hyperaktiviertem mTOR und reduzierter Autophagie unter katabolen Stoffwechselbedingungen. Dies ist der erste Bericht über eine funktionelle Charakterisierung einer HERC1 Mutation in humanen Zellen und gewährt einen ersten Einblick in den möglichen Pathomechanismus des MDFPMR Syndroms.
Aims: The aim of this study was to identify the molecular cause of an inherited disease in two patients. The two sisters from a consanguineous marriage presented with macrocephaly, dysmorphic facies, psychomotor retardation, and seizures. Methods: We assumed a rare, recessively inherited, genetic defect underlying the disease of our patients, and thus used Whole Exome Sequencing to obtain DNA sequence information. To reduce the number of potential disease-causing variants, I applied a series of filter steps, autozygosity mapping, and subsequent in-depth analysis of promising variants. I considered the nature of the variant itself, assumed gene function and a possible association to the patients’ clinical phenotype. The finally remaining, probable disease-causing variant, was subject to functional analyses to assess its relevance. A conducted Western Blot analysis and immunofluorescence staining of the protein encoded by the altered gene with material from patient fibroblasts was compared to controls to visualize differences in amount and subcellular location. Cell-based assays focusing on autophagy and growth / proliferation provided further in-sights into the pathomechanism. Results: Whole Exome sequencing revealed a novel homozygous missense variant in the C-terminal domain of the HERC1 gene [chr15:g63,907,989C>G GRCh37.p11 | c.14,072G>C NM_003922 | p.(Arg4,691Pro)]. HERC1 is a giant protein with ubiquitin ligase function acting as upstream regulator in the mTOR pathway via its interaction with TSC2. mTOR is a central signaling hub with impact on autophagy, energy metabolism, lipid- and protein synthesis, dependent on nutrient levels and environmental cues. My functional analyses revealed abnormal high mTOR activity in the patient fibroblasts during catabolic cellular state as compared to controls. Moreover, autophagy in patient fibroblasts was less active than normally expected in a catabolic situation. Conclusion: Proven or assumed loss-of-function mutations in HERC1 have previously been reported in patients with macrocephaly, facial dysmorphism, and psychomotor retardation, a symptom complex which has found its way into the literature as the MDFPMR syndrome (OMIM #617011). I conclude that the here described HERC1 missense mutation is disease-causing and leads to a gain-of-function of the encoded protein resulting in mTOR hyperactivation with reduced autophagy in catabolic cellular state. This is the first report about functional studies on a HERC1 mutation in human cells providing insight into the possible pathomechanism at the basis of the MDFPMR syndrome.
