This thesis describes the results of spectroscopic investigations, with a focus on X-ray absorption spectroscopy, on the three oxygen-tolerant Ni-Fe hydrogenases from Ralstonia eutropha. A general introduction to hydrogenases and to the XAS technique is given in Chapter 1. A basic characterization of the metal cofactors with respect to structural and redox features in the catalytic cycle has been achieved. In Chapter 2 the results of the characterization of the particularly complex NAD-reducing soluble hydrogenase (SH) are shown. XAS investigations revealed the presence of a non-standard Ni- Fe site in the SH where the Ni is not only coordinated by four thiols from cysteines, but presumably also by oxygen atoms from sulfenates. Activation of the SH for H2 catalysis involves removal of an oxygen species from Ni. A tentative reaction scheme for activation and H2 turnover is presented which comprises the available information from XAS, EPR, and FTIR. The absence of EPR-detectable Ni(III) states points to an unusual catalytic pathway for H2 oxidation in the SH. To dwell on the apparent structural flexibility of the Ni-Fe site in the SH, a specific mutant, H16L, has been investigated. This protein shows a bias from H2-cleavage to �production (Chapter 3). XAS, EPR, and FTIR results revealed that in the mutant, the Ni-Fe site is modified compared to the wildtype, towards a more standard-like configuration. In addition, in these investigations two pathways of electron transfer in the enzyme were unraveled. Reductive activation of the SH involves a [2Fe-2S] cluster in the HoxU subunit, whereas electron transfer out of the Ni-Fe site occurs via a [4Fe-4S] cluster in HoxY. The regulatory hydrogenase (RH) functions as a H2-sensor. Previous studies pointed to the presence of unusual Fe-S clusters in this enzyme. In Chapter 4, XAS investigations at the Fe K-edge are presented, which allowed monitoring the EPR-invisible reduction of Fe-S clusters in the RH and their structural characterization. The XAS data point to the presence of two [2Fe-2S] clusters and to one [4Fe-3S-3O] cluster in the RH. The reduction of these Fe-S clusters may be the first step in H2-sensing and initiate the signal transduction chain, leading to the expression of the energy converting Ni-Fe hydrogenases in R. eutropha. Advanced microbiology techniques have allowed isolating the large subunit of the RH. Thereby, for the first time XAS investigations not only on the Ni, but also on the Fe of the Ni-Fe site have become feasible (Chapter 5). Two populations of the enzyme have been characterized. In one of these, the Ni is absent, but the Fe is present, carrying its one CO and two CN ligands. These results provide good evidence that the Fe with its diatomic ligands first is assembled into the Ni-Fe binding site during the sophisticated maturation process. The membrane-bound hydrogenase (MBH) recently has gained much interest because it is promising for biotechnological applications. In Chapter 6, the first XAS results and EPR investigations on the metal cofactors in this enzyme are presented. In comparison, the standard-hydrogenase of D. gigas has been studied. Pronounced differences in the structures of the Ni-Fe site and the Fe-S clusters in the MBH compared to D. gigas were uncovered which may be related to the oxygen-tolerant catalytic behavior of the MBH. Chapter 7 provides a comprehensive overview of the spectroscopic results on the four hydrogenases investigated in this thesis. The current information on the basis of the available spectroscopic information is condensed into tentative reaction schemes of the structural organization, relative positioning of cofactors in the protein, and sequence of redox events in the catalytic cycle of the three hydrogenases of R. eutropha.
Diese Arbeit beschreibt die Ergebnisse der spektroskopischen Untersuchungen an den drei sauerstofftoleranten Ni-Fe-Hydrogenasen von Ralstonia eutropha mit einem Schwerpunkt auf Röntgenabsorptionsspektroskopie. Eine allgemeine Einführung in Hydrogenasen und die XAS-Technik wird in Kapitel 1 gegeben. Die metallischen Kofaktoren wurden hinsichtlich ihrer Struktur- und Redox- Eigenschaften im katalytischen Zyklus charakterisiert. In Kapitel 2 werden die Ergebnisse der Charakterisierung der besonders komplexen NAD+-reduzierenden, löslichen Hydrogenasen (SH) gezeigt. XAS-Untersuchungen belegen die Anwesenheit eines nicht-standard Ni-Fe-Zentrums in der SH, in der das Ni nicht nur von vier Thiol-Gruppen der konservierten Zysteine koordiniert wird, sondern vermutlich auch von Sauerstoffatomen von Sulfenaten. Für die Aktivierung der SH für die H2-Katalyse ist die Entfernung einer Sauerstoff- Spezies am Nickel entscheidend. Ein vorläufiges Reaktionsschema für die Aktivierung und den H2 -Umsatz, welches die vorhandenen Ergebnisse von XAS und EPR zusammenfasst, wird vorgestellt. Die Abwesenheit von EPR-detektierbaren Ni(III)-Zuständen deutet auf einen ungewöhnlichen Reaktionsweg der H2-Oxidation in der SH hin. Um die offensichtliche strukturelle Flexibilität des Ni-Fe-Zentrums in der SH näher zu beleuchten, wurde eine spezielle Mutante (H16L) untersucht. Dieses Protein zeigt eine Präferenz für H2-Erzeugung und nicht für H2-Spaltung wie der Wildtyp (Kapitel 3). XAS-, EPR- und FTIR- Ergebnisse zeigen, dass das Ni-Fe-Zentrum in der Mutante verglichen mit dem Wildtyp eher eine Standardkonfiguration einnimmt. Zusätzlich wurden in diesen Untersuchungen zwei Elektronentransfer-Pfade im Enzym aufgedeckt. Bei der reduktiven Aktivierung der SH ist ein [2Fe-2S]-Cluster in der HoxU- Untereinheit involviert, wohingegen der Elektronentransfer aus dem Ni-Fe- Zentrum über einen [4Fe-4S]-Cluster in der HoxY-Untereinheit geschieht. Die regulatorische Hydrogenase (RH) ist ein H2-Sensor. Frühere Studien deuten darauf hin, dass das Enzym ungewöhnliche Fe-S-Cluster enthà lt. In Kapitel 4 werden XAS-Untersuchungen vorgestellt, die es ermöglichten, die durch EPR nicht detektierbare Reduktion von Fe-S-Clustern in der RH zu beobachten und sie strukturell zu charakterisieren. Die XAS-Daten deuten auf zwei [2Fe-2S]- und einen [4Fe-3S-3O]- Cluster in der RH hin. Die Reduktion dieser Fe-S-Cluster könnte der erste Schritt in der Reaktionskaskade der H2-Detektion sein und außerdem am Beginn der Signalübertragungskette stehen, welche zur Expression der energieumwandelnden Ni-Fe-Hydrogenasen in R. eutropha führt. Fortgeschrittene mikrobiologische Techniken ermöglichten die Isolation der größten Untereinheit der RH. Dadurch wurden erstmalig XAS-Untersuchungen nicht nur am Ni, sondern auch am Fe des Ni-Fe-Zentrums möglich (Kapitel 5). Charakterisiert wurden zwei Populationen des Enzyms, wobei in einer das Ni fehlt, aber das Fe mit seinen zwei CN- und einem CO-Liganden bereits vorhanden ist. Diese Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass das Fe mit seinen zweiatomigen Liganden während des komplizierten Reifungsprozesses zuerst in der Ni-Fe-Bindestelle eingebaut wird. Die membrangebundene Hydrogenase (MBH) hat in letzter Zeit viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen, da sie vielversprechend für biotechnologische Anwendungen ist. In Kapitel 6 werden die ersten XAS-Ergebnisse und EPR-Untersuchungen der metallischen Kofaktoren in diesem Enzym vorgestellt. Zum Vergleich wurde die Standard-Hydrogenase aus D. gigas untersucht. Ausgeprägte Unterschiede in den Strukturen des Ni-Fe- Zentrums und der Fe-S-Cluster in der MBH im Vergleich zu D. gigas wurden ermittelt. Diese könnten das sauerstofftolerante katalytische Verhalten der MBH determinieren. Kapitel 7 gibt einen zusammenfassenden Überblick über die spektroskopischen Ergebnisse zu den vier Hydrogenasen, die in dieser Arbeit untersucht wurden. Die spektroskopischen Ergebnisse und weitere Informationen werden in vorläufigen Reaktionsmodellen zusammengefasst, die die strukturelle Organisation, die relative Anordnung der Kofaktoren im Protein und die Sequenz der Redoxreaktionen im katalytischen Zyklus der drei Hydrogenasen von R. eutropha enthalten.
