DNA with an abasic site is a cyto-toxic intermediate in the base excision repair (BER) pathway that is handled by the enzyme Apuridinic/Apyrimidinic endonuclease (APE1) [99, 56, 168, 90]. Several kinetics and thermodynamics aspects of the mechanism by which the APE1 enzyme processes its abasic DNA substrate have been discussed in this thesis. APE1 is an endonuclease that is it cleaves the DNA backbone at a non-terminal site, here at the abasic site. To obtain eminent insight about the catalytic role of amino acid residues and magnesium ions which are representatively recognized in active sites of endonuclease enzymes, quantum mechanical calculations of reaction pathways based on various cluster models mimicking such active sites of endonuclease enzymes have been performed and subsequently discussed in section 4. In this light our results underline the importance of an enzymatic active site architecture in the catalytic reaction, given the substrate is properly positioned. As a side-effect, we were able to evaluate the semi empirical method DFTB3/3OB [132] by comparison of reaction pathways calculating in different cluster models with the same reaction pathways calculations on the DFT level of theory (B3LYP/6- 31G(d,p)). Comparison of the obtained mechanisms and barriers obtained by DFT and DFTB for the minimalistic (cluster) models may nominate DFTB with reasonable accuracy and computational cost as a potential candidate for quantum method in hybrid QM/MM (quantum mechanics/molecular mechanics) approaches for phosphodiester hydrolysis in an enzymatic environment. However in the “reductionist approach” employed to evaluate multiple plausible types of reaction mechanism, the protein’s flexibility and heterogeneous electrostatic environment of protein residues is not taken into account. To enable reaction pathway caculations of the DNA cleavage mechanism in the full APE1 enzyme a model of a reaction-competent APE1-DNA reactant complex has been built, based on available crystal structure data and mutagenesis experiments from the literature [168, 133, 99, 92]. To remedy the lack of lucid information about structural details of APE1/DNA substrate bounded to Mg2+ ion molecular dynamic simulation together with pKa calculations for important amino acid residues in the active-site of the enzyme have been carried out (see section 5). To investigate the potential effect of metal ion binding on the stabilization of the active site in the Ape1-DNA substrate complex, the number and position of the metal ion(s) have been varied and single point mutations of vital active-site residues in the substrate complex of Ape1-DNA have been simulated. Taken together, the most likely model for an Ape1-DNA substrate complex has one Mg2+-ion located at binding site D and His309 in protonated form. At the D site, the metal ion may play a catalytic role in leaving group departure. This scenario allows Tyr171 and His309 to form hydrogen-bonds to the phosphate group that may help DNA binding as well as stabilizing a pentacovalent transition state/intermediate. Asn212 acts in properly positioning the nucleophile which can then transfer a proton to Asp210. A combined QM/MM approach wherein the active site was treated quantum mechanically and the remaining enzyme classically empowered us to investigate the enzymatic reaction pathways of phosphodiester backbone cleavage by APE1 enzyme and enabled us to depict a more realistic picture of the enzyme’s functions in abasic DNA cleavage (see section 6). Opposed to the “reductionist approach”, the QM/MM approach is accurate enough and computationally efficient to gain electronic level insight into the chemical reaction while taking the protein environment explicitly into account and as such allowed the contribution of individual residues in the enzyme environment to be quantified. To find the energetically most favorable pathway for phosphate hydrolysis catalyzed by APE1 enzyme, several possible reaction mechanisms were initially explored by potential energy calculations. As dynamical effects are important in the reaction progress, free energy calculations have subsequently been performed on selected pathways (based on their potential energy profile). According to our QM/MM calculated enzymatic reaction pathways of phosphodiester backbone cleavage by the APE1 enzyme, the dissociative type of mechanism is the most favorable pathway. Herein an important role is played by a metal ligated water molecule that donates a proton to the leaving group while the cleaved sugar backbone migrates toward the Mg2+ ion. This allows a water molecule, activated by proton transfer to Asp210, to attack the phosphorous atom of abasic DNA as nucleophile. The APE1 enzyme as an indispensable key player in BER has been discussed in atomic resolution in this thesis, Our efforts promote the understanding of catalytic and dynamical features of the APE1 enzyme in the abasic DNA cleavage mechanism, including effects of pH and single-site mutations. The detailed insight thus gained may be helpful in designing inhibitors for APE1 as a potential drug target in cancer chemotherapy.
Abasische DNA ist ein cytotoxisches Intermediat des Basenexizions Reparaturmechanismus (BER), welches durch das Enzym apuridinische/apyrimidinische Endonuklease (APE1) [99, 56, 168, 90] weiter prozessiert wird. In dieser These wurden verschiedene kinetische und thermodynamische Aspekte des Mechanismus, durch welchen APE1 Enzyme ihr abasisches DNA Substrat umwandeln, diskutiert. APE1 ist eine Endonuklease, welche das DNA Rückgrat an nicht-terminaler Position spaltet, in diesem Fall an der abasischen Position. Um tiefere Einsicht in die katalytische Funktion von Aminosäure-Seitenketten und Magnesiumionen, welche representativ für das aktive Zentrum von Endonukleasen stehen, zu erhalten, wurden quantummechanische Berechnungen von Reaktionswegen basierend auf verschiedenen Cluster-Modellen, die das aktive Zentrum von Endonukleasen imitieren, durchgeführt und nachfolgend im Abschnitt 4 diskutiert. In diesem Licht unterstreichen unsere Ergebnisse die Relevanz der Architektur des aktiven Zentrums für die katalytische Reaktion, vorausgesetzt das Substrat ist korrekt positioniert. Als Nebeneffekt waren wir in der Lage die semi-empirische Methode DFTB3/3OB durch den Vergleich von Reaktionswegen berechnet in verschiedenen Cluster-Modellen mit gleichen Reaktionsweg-Parametern auf DFT -Level zu evaluieren (B3LYP/6-31G(d,p)). Der Vergleich, der durch DFT und DFTB erhaltenen Mechanismen und Barrieren für die minimalistischen (Cluster) Modelle, nominiert DFTB [132] mit angemessener Genauigkeit und Rechenkosten als potentiellen Kandidaten für quantummechanische Methoden in hybrid QM/MM (Quantummechaniken/ Molekulare Mechaniken) Ansätzen für Phosphodiester-Hydrolyse in enzymatischer Umbegung. Jedoch wird im oft verwendeten „reduktionistischen Ansatz“ zur Evaluierung multipler plausibler Formen von Reaktions-Mechanismen die Fexibilität des Proteins und die heterogene elektrostatische Umgebung der Protein-Seitenketten nicht berücksichtigt. Um Reaktionsweg-Berechnungen des DNASpaltungs-Mechanismus im gesamten APE1 Enzym zu ermöglichen, wurde ein Modell eines Reaktionskompetenten APE1-DNA Edukt-Komplexes gebaut, basierend auf den in der Literatur [168, 133, 99, 92]. vorhandenen Krystallstrukturdaten und Mutagenesis-Experimenten. Um den Fehlen von Informationen über strukturelle Details von APE1/DNA-Substrat gebunden an Mg2+ Ionen entgegenzuwirken, wurden Moleküldynamik-Simulationen zusammen mit pKa Berechnungen für wichtige Aminosäure-Seitenketten im aktiven Zentrum durchgeführt (siehe Abschnitt 5). Zur Untersuchung des potentiellen Effekts der Bindung von Metallionen auf die Stabilisierung des aktiven Zentrum im APE1-DNA Substratkomplex wurde die Anzahl und Position der Metallionen variiert und Punktmutationen wesentlicher Seitenketten des Substratkomplex von APE1-DNA simuliert. Detailierte Analyse dieser Simulationen versorgte uns mit angemessenen Statistiken und Informationen über strukturelle Details des aktiven Zentrums von APE1. Zusammenfassend beiinhalted das wahrscheinlichste Modell für den APE1-DNA Substratkomplex ein Mg2+-Ion lokalisiert an der Bindungsstelle D sowie ein His309 in protonierter Form. And der D Bindungsstelle könnte das Metallion eine katalytische Rolle bei der Abspaltung der Abgangsgruppe einnehmen. Dieses Szenario erlaubt Tyr171 und His309 Wasserstoffbrücken zu den Phosphatgruppen zu formen, welche bei der DNA-Bindung sowie bei der Stabilisierung eines pentakovalenten Überganszustands/ Intermediates behilflich sein könnten. Asn212 spielt bei der korrekten Positionierung des Substrats eine Rolle, welches dann ein Proton auf Asp210 übertragen kann. Ein kombinierter QM/MM Ansatz, in welchem das aktive Zentrum quantummechanisch und das übrige Enzym klassisch betrachtet wurde, ermöglichte uns die enzymatischen Reaktionswege der Phosphodiesterrückgrat-Spaltung durch APE1 zu untersuchen und befähigte uns zu einer realistischeren Abbildung der enzymatischen Funtkionen der abasischen DNA Spaltung (siehe Abschnitt 6). Im Gegensatz zum „reduktionistischen Ansatz“ ist der QM/MM Ansatz präzise genug und rechentechnisch effizient um auf elektorischem Level Einsicht in chemische Reaktionen bei explizieter Berücksichtigung der Proteinumgebung zu erhalten und erlaubt als dieses die Quantifizierung der Beiträge individueller Seitenketten der Enzym-Umgebung. Um den engergetisch favorisierten Reaktionsweg für Phosphathydrolyse katalysiert durch APE1-Enzyme zu indentifizieren, wurden mehrere Reaktionsmechanismen initial durch Potentialenergie-Berechnungen untersucht. Aufgrund der Wichtigkeit dynamischer Effekte für den Reaktionsprozess wurden Berechnungen mit freier Energie stückweise an ausgewählten Reaktionswegen durchgeführt (basierend auf ihrem potentiellen Energieprofil). Zufolge unserer durch QM/MM berechneten enzymatischen Reaktionswege der Phosphodiester RückgratSpaltung durch APE1 Enzyme ist der dissoziative Mechanismus der favorisierte Reaktionsweg. In diesem wird eine wichtige Rolle durch ein Metalliganden gebundenes Wasser-Molekül eingenommen, welches Protonen an die Abgangsgruppe überträgt während das gespaltene Zucker-Rückgrat in Richtung des Mg2+ Ions wandert. Das erlaubt einem Wasser-Molekül, aktiviert durch durch Protonentransfer zu Asp210, als Nukleophil das Phosphoratom der abasischen DNA anzugreifen. Das APE1-Enzym wurde in dieser Thesis als ein unverzichtbarer Schlüsselspieler des BER mit atomarer Auflösung diskutiert. Unsere Bemühungen fördern das Verständnis der katalytischen und dynamischen Eigenschaften des APE1 Enzyms im abasischen DNA Spaltungs-Mechanismus unter Einbeziehung von Effekten durch pH und Punktmutationen. Der hierdurch erhaltene Einblick könnte für das Design von Inhibitoren für APE1 als potentielles Ziel für Therapeutika in der Chemotherapie hilfreich sein.
