Cutis laxa Syndrome sind gekennzeichnet durch faltige, inelastische Haut, die zu einem vorgealterten (progeroiden) Aussehen führt. Die autosomal rezessive Cutis laxa Typ 2A (ARCL2A) weist außerdem eine Wachstumsverzögerung, eine neuronale Migrationsstörung und einen Glykosylierungsdefekt auf und wird durch Mutationen im Gen ATP6V0A2 verursacht. Dieses kodiert für die a2 Untereinheit der V-ATPase, ein Proteinkomplex, welcher ATP-abhängig Protonen über Membranen transportiert und den intraluminalen pH in Endosomen und dem Golgiapparat reguliert. Da Zellen mit defekter a2 Untereinheit einen verlangsamten retrograden Transport im Golgiapparat aufweisen, wurde außerdem über eine Rolle des Proteins in der Vesikelfusion spekuliert. Mittels einer markierten a2 Untereinheit konnte in HeLa-Zellen eine Lokalisation im Trans-Golgiapparat bestätigt werden. Das Ausschalten der endogenen Expression der a2 Untereinheit führte zur Akkumulation von frühen Endosomen, Lysosomen und Cholesterin in der Nähe des Golgiapparates. Ein ähnlicher zellulärer Phänotyp konnte durch eine experimentelle Erhöhung des intraluminalen pH-Wertes erreicht werden. Um die physiologische Funktion der a2 Untereinheit im Organismus zu untersuchen, wurden eine konditionelle Atp6v0a2 Flox Knock-out und eine Atp6v0a2 R755Q Knock-in Mauslinie erzeugt, in der durch Einfügen der Punktmutation R755Q der Protonentransport durch die a2 Untereinheit blockiert wurde. Durch eine in der Keimbahn aktive Cre-Rekombinase wurde aus dem konditionellen ein konstitutiver Knock-out (Atp6v0a2-/-) erzeugt. Das Atp6v0a2-/- Mausmodell zeigte im homozygoten Zustand einen kompletten Verlust des a2 Proteins und eine gute Übereinstimmung mit dem humanen ARCL2A Phänotyp. Die homozygoten Mutanten hatten ein verringertes Gewicht, die Dicke der Dermis war reduziert, die Knochendichte vermindert und der frontale Kortex zeigte Hinweise auf eine neuronale Migrationsstörung. Männliche Mäuse waren aufgrund einer Globozoospermie infertil. Im Gegensatz zur humanen Erkrankung konnte jedoch kein eindeutiger Hinweis auf eine veränderte Glykosylierung gefunden werden. Die Mauslinie Atp6v0a2 R755Q zeigte trotz eines stabilen mutierten a2 Proteins einen ähnlichen Phänotyp wie das Atp6v0a2-/- Modell. Somit wurde die zentrale Funktion der a2 Untereinheit in der Regulation des pH-Werts bekräftigt, neue phänotypische Aspekte der a2 Defizienz aufgezeigt und Mausmodelle zur Erprobung neuer Therapien etabliert.
Cutis laxa syndromes are characterized through wrinkled and inelastic skin, causing a prematurely aged (progeroid) appearance. Patients with an autosomal rezessive Cutis laxa type 2a (ARCL2A) suffer from growth delay, a neuronal migration defect and a defect of glycosylation. The ARCL2A is caused by mutations in the ATP6V0A2 gene, which encodes the a2 subunit of the V-ATPase, a protein complex that hydrolyses ATP to trigger the transport of protons through membranes and therefore regulates the intraluminal pH of endosomes and the Golgi apparatus. Furthermore, a role in vesicle fusion was speculated due to the fact that cells with a defect of the a2 subunit show a delayed retrograde trafficking within the Golgi apparatus. The use of a tagged a2 subunit confirmed the localisation within the trans Golgi apparatus in HeLa cells. Turning off the endogenous expression of the a2 subunit led to the accumulation of early endosomes, lysosomes and cholesterol close to the Golgi apparatus. A similar cellular phenotype could be generated through the experimental increase of the intraluminal pH. To identify the physiologic function of the a2 subunit in the organism, a conditional Atp6v0a2 flox knock-out and an Atp6v0a2 R755Q knock-in mouse model were generated. In the knock-in model the R755Q mutation leads to a blockage of the proton transport through the a2 subunit. The conditional knock-out turned to a constitutive knock-out (Atp6v0a2-/-) by using a germline active cre recombinase. In the homozygous state the Atp6v0a2-/- model revealed a complete loss of the a2 protein and a high correspondence with the human ARCL2A phenotype. The homozygous mutants displayed a decreased body weight, a reduced thickness of the dermis, a diminished bone density and in the frontal cortex, aspects of a disrupted neuronal migration were observed. Male mice were infertile due to a globozoospermia. In contrast to the human disease, there was no clear hint towards an altered glycosylation. Although the mutated protein was stable in the Atp6v0a2 R755Q mouse model, the mice showed a similar phenotype as the Atp6v0a2-/- mouse line. In conclusion, the central function of the a2 subunit for the regulation of the pH could be affirmed, new phenotypic aspects of the a2 deficiency were revealed and mouse models were established to test new therapies.
