Despite intense research and immense demand there is no RSV vaccine available today. Modern subunit vaccines require adjuvants to generate a sufficiently strong immune response. By editing the glycosylation pattern of the RSV-F Protein covalently coupled adjuvants are produced, which generate comprehensive immune responses via the activation of the innate immune system. In this work recombinantly produced variants of the RSV-F protein with defucosylated or xylosylated Nglycans were tested for their potential to activate the immune system. For that, cytokines from cell culture supernatants were quantified and methods for gene expression analysis of stimulated cells were established. In preliminary PBMC stimulation experiments the influence of cryopreservation on cells was examined and the expression of cytokines on gene and protein level was correlated. Within the scope of stimulation experiments with complex cell mixtures (PBMC and DC) the reference genes SDHA, TBP and PPIA were identified as stably expressed in order to establish a valid gene expression analysis. A mathematical conversion of quantitative transcript numbers from a probe-based direct RNA detection assay (NanoString®) and the relative quantification via qPCR was developed. The cytokine pattern in cell culture supernatants from long-term experiments performed with PBMC, mDC and each vaccine candidate in a highly complex perfusion reactor system (HuALN®) were quantified by automated bead-based multiplex analytics. In connection with the analysis of broad gene panels increased immune responses could be detected caused by the glycosidically altered RSV-F proteins. Defucosylation leads to a comprehensive activation of the immune system. Xylosylated RSV-F additionally activates components of the innate immune system. Furthermore, there is evidence that the ratio of the Th1 and Th2 based immune response can be modified by the grade of the defucosylation. The applied and established methods are suited to distinguish the potency of vaccine candidates with minor structural differences. In order to perform stimulation experiments in a higher throughput, this work contributed to the establishment of a miniaturized bioreactor. Leakage testing of the reactor via fluorescence microscopy and the examination of the biocompatibility of all single components directly influenced the reactor design, its assembly and connection techniques as well as the choice of materials. The reactors functionality was confirmed in different 2D and 3D cultivation approaches by means of a long-lasting high cell viability. The stronger modulated immune response evoked by modified glycosidic structures provides a promising method that can be applied to other pathogens, too. By its potential for higher throughput (more time points, more replicas) the miniaturized perfusion reactor could be able to provide a more precise insight into the immunological processes.
Trotz intensiver Forschung und immensen Bedarfs steht heutzutage kein RSV-Impfstoff zur Verfügung. Moderne Subunit-Vakzine bedürfen einer Adjuvantierung, um eine ausreichend starke Immunantwort zu generieren. Mit der Veränderung von Glykoslierungsmustern des RSV-F Proteins wird eine kovalent gekoppelte Adjuvantierung hergestellt, die über die Aktivierung des angeborenen Immunsystems eine umfassende Immunantwort generiert. In dieser Arbeit wurden rekombinant hergestellte Varianten des RSV-F Proteins mit defukosylierten oder xylosylierten N-Glykanen auf ihr Potential, das Immunsystem zu aktivieren, untersucht. Dazu wurden Zytokine aus Zellkulturüberständen quantifiziert und Methoden zur Genexpressionsanalyse stimulierter Zellen etabliert. In Vorbereitung auf Stimulationsexperimente mit PBMCs wurde der Einfluss der Kryokonservierung auf Zellen untersucht und die Zytokinexpression auf Gen- und Proteinebene korreliert. Im Rahmen der Stimulationsexperimente mit komplexen Zellgemischen (PBMC und mDC) wurden die stabil exprimierten Referenzgene SDHA, TBP und PPIA für die Etablierung einer validen Genexpressionsanalyse identifiziert. Dabei wurde eine mathematische Konvertierung quantitativer Transkriptzahlen aus dem Sonden-basierten direkten RNA-Nachweis (NanoString®) und der relativen Quantifizierung mittels qPCR entwickelt. Die Zytokinmuster in Zellkulturüberständen aus Langzeitstimulationsexperimenten, welche mit PBMC, mDC und den beiden Impfstoffvarianten in einem komplexen Perfusionsreaktorsystem (HuALN®) durchgeführt worden waren, wurden mittels automatisierter Bead-basierter Multiplexanalytik quantifiziert. Im Zusammenhang mit der Untersuchung umfangreicher Genpanels konnten verstärkte Immunreaktionen durch die glykosidisch veränderten RSV-F Proteine nachgewiesen werden. Die Defukosylierung führt zu einer breiten Aktivierung des zellulären und humoralen adaptiven Immunsystems. Das xylosylierte RSV-F aktiviert zusätzlich Komponenten des angeborenen Immunsystems. Zudem gibt es Hinweise darauf, dass durch den Grad der Defukosylierung das Verhältnis zwischen Th1 und Th2 basierter Antwort modifiziert werden kann. Mit den verwendeten und etablierten Methoden ist es möglich, die Potenz von Impfstoffkandidaten mit geringen strukturellen Veränderungen zu unterscheiden. Um die komplexen Stimulationsexperimente in einem höheren Durchsatz durchführen zu können, wurde an der Entwicklung eines miniaturisierten Bioreaktors mitgewirkt. Die Untersuchungen der Dichtheit des Reaktors mittels Fluoreszenzmikroskopie und der Biokompatibilität der einzelnen Komponenten hatten direkten Einfluss auf das Design des Reaktors, dessen Aufbau- und Verbindungstechnik sowie die Wahl der Materialien. Die Funktionalität konnte in verschiedenen 2D und 3D Kultivierungsansätzen über eine langanhaltende Zellviabilität bestätigt werden. Die verstärkte Modulierung der Immunantwort, hervorgerufen durch modifizierte Glykanstrukturen, zeugt von einer aussichtsreichen Methode, die auf andere Pathogene angewandt werden kann. Das höhere Durchsatzpotential des miniaturisierten Perfusionsreaktors (mehr Zeitpunkte, mehr Replikate) kann zukünftig einen präziseren Einblick in die immunologischen Vorgänge gewähren.
