5\. Zusammenfassung Beim DnaA Protein handelt sich um das zentrale Initiatorprotein der bakteriellen Replikation. DnaA bindet spezifisch an seine Erkennungssequenz im oriC. Dies führt zur Ausbildung des Initiationskomplexes und zur lokalen Entwindung der DNA im linken Bereich von oriC. Auf die aufgeschmolzene Region werden zwei Helikasen geladen, was zur Etablierung einer bidirektionalen Replikation führt. Ziel der Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung der Interaktionsdomänen vom Initiatorprotein DnaA mit der replikativen Helikase DnaB und die Aufklärung des DnaA vermittelten Ladens der Helikase am oriC. Mit Hilfe des Cos- Suppressions Tests konnte zunächst eine Region von DnaB (aa 203-213) identifiziert werden, die im Kontext mit den benachbarten Aminosäuren (DnaB[154-206] bzw. DnaB[203-471]) die Initiation der Replikation, gemessen als Wachstum bei 30 °C, inhibiert. Die Suppression der Initiation ist wahrscheinlich auf direkte Interaktion von DnaB mit DnaA zurückzuführen. Ein in vivo Test, bei dem das Aufschmelzen der DNA vom Laden der Helikase abgekoppelt ist, wurde benutzt um Regionen von DnaA zu identifizieren, die am Laden der Helikase beteiligt sind. Die DnaA Domänen 1 (aa 24-86), 3 (aa 135-373) und Domäne 4 (aa 374-467) sind für das Laden der Helikase essentiell. Mutationen innerhalb von Domäne 3, die zu einem Verlust der Nukleotidbindefähigkeit von DnaA führen, aber nicht die Struktur der Domäne verändern, sind in der Lage die Helikase zu laden. Solid-Phase Protein Binding Assays zeigen, dass DnaA und DnaB direkt miteinander interagieren. Die Interaktion ist unabhängig von einer DNA Bindung von DnaA oder DnaB. Beide Proteine besitzen zwei Interaktionsdomänen füreinander. Der DnaA N-Terminus (aa 24-86) interagiert mit DnaB (aa 203-213) und die DnaA Domäne 3 (aa 130-149) mit dem DnaB a-Fragment (aa 1-156). Bei der Interaktion vom DnaA N-Terminus (aa 24-86) mit DnaB (aa 203-213) handelt es sich um die primären Interaktionsdomänen der Proteine. Die DnaA Domäne 4 ist nicht direkt an einer Interaktion mit DnaB beteiligt. Zur Ausbildung des Initiationskomplexes am oriC von E. coli und am Origin vom pSC101 ist eine DnaA-DnaA Interaktion notwendig. Die Selbstinteraktion von DnaA findet über den DnaA N-Terminus (aa 1-77) statt und überlappt mit der primären Interaktionsdomäne von DnaA mit DnaB. Die Selbstinteraktionsdomäne und die minimale DNA-Bindedomäne von DnaA sind notwendig und hinreichend um einen DnaA-RepA spezifischen Komplex am Replikationsorigin vom pSC101 auszubilden. Bei der DnaA-DnaA Interaktion über den N-Terminus handelt sich um eine ýlong-range Interaktioný. Das Laden der Helikase wurde in vitro an einem artifiziellen Substrat, das den aufgeschmolzenen oriC simuliert, und mit dem FI*-Test untersucht. Ein DnaA Monomer ist ausreichend um die Helikase auf einen benachbarten Einzelstrang zu laden. DnaA, das an die DnaA-Box R1 im oriC gebunden hat, lädt in vitro die Helikase auf den unteren DNA Strang. Das Laden der Helikase ist unabhängig von der Sequenz der einzelsträngigen DNA. Die Helikase für den anderen DNA Strang wird von einer anderen DnaA-Box im oriC, vermutlich der DnaA-Box R2, geladen.
6\. Summary The DnaA protein is the central initiator protein of the bacterial replication. DnaA binds specifically to its recognition sequence within oriC. This leads to a specialiced nucleoprotein complex (initial complex) and results in the local unwinding of the DNA in the left half of oriC. DnaA recruits and loads the helicase onto the unwound region. Establishing of a bidirectional replication requires loading of two helicases. The aim of the work was the identification and characterization of interaction domain(s) between the initiator protein DnaA and the replicative helicase DnaB as well as studies of the DnaA mediated loading of the helicase at oriC. Using the Cos-assay I identified a region of DnaB (aa 203-213) that was able to suppress the cold-sensitive phenotype of the dnaA219(Cos) strain in context with adjacent protein regions upstream (DnaB[154-206]) or downstream (DnaB203-471]), respectively. The inhibition of initiation, measured as growth at 30 °C, is presumably due to a direct interaction between DnaA and DnaB. An in vivo assay was used to identify regions of DnaA involved in helicase loading. In this assay the loading of the helicase is uncoupled from other steps, especially from the unwinding of the DNA. DnaA domains 1 (aa 24-86), 3 (aa 135-373) and 4 (aa 374-467) are essential for the loading of the helicase. Mutations within domain 3 that result in a decreased nucleotide binding affinity but do not affect the structure of the domain could load the helicase. Solid-phase Protein Binding Assays show that DnaA and DnaB interact directly. The interaction requires no DNA contact. Both proteins have two interaction domains. The DnaA N-terminus (aa 24-86) interacts with DnaB (aa 203-213) and DnaA domain 3 (aa 130-149) with the DnaB a-fragment. The primary interaction domains of the proteins are the DnaA N-terminus (aa 24-86) and DnaB (aa 203-213). DnaA domain 4 is not involved in a direct interaction with the helicase. The formation of a specific nucleoprotein complex at oriC of E. coli and the origin of pSC101 requires a DnaA-DnaA interaction. The self- interaction of DnaA happens via the N-terminus (aa 1-77). The DnaA-DnaA interaction domain overlaps with the DnaA-DnaB interaction domain. DnaA domains 1 and 4 are necessary and sufficient to promote pSC101 replication. The DnaA homooligomerisation via the N-terminus is a long-range interaction. A substrate that mimics the unwound region was used to simulate the loading of the helicase onto oriC. A single DnaA is sufficient to load the helicase onto an adjacent ssDNA. DnaA bound to the DnaA box R1 in oriC loads the helicase onto the lower ssDNA strand. The loading of the helicase is independent of the sequence of the single-stranded DNA. The helicase for the other DNA strand is loaded by another DnaA protein, presumably the DnaA box R2.
