EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG: Die DNA-Methyltransferasen DNMT1, DNMT3a und DNMT3b katalysieren die Methylierung von DNA, welche über komplexe epigenetische Prozesse zur Komprimierung und Inaktivierung des entsprechenden DNA-Abschnitts führt. Im physiologischen Zustand findet sich im Genom eine globale Hypermethylierung bei Hypomethylierung der Promotor-Regionen von Genen. In der Tumorgenese hingegen werden diese Promotoren vor allem bei Tumorsuppressorgenen häufig hypermethyliert und damit inaktiviert, während das übrige Genom aberrant hypomethyliert ist. Bei einigen Tumoren korreliert nach heutiger Studienlage die verstärkte Expression von DNMTs in Tumorzellen mit dieser Hypermethylierung. DNMT-Inhibitoren konnten teilweise in Phase-I- bis III-Studien Hypermethylierungen aufheben. Die DNMT-Expression bei AML und ALL- Rezidiv im Kindesalter wurde bislang nicht analysiert. In dieser Arbeit wurde die Expression der für die aberrante Methylierung in Tumorzellen hauptverantwortlichen Enzyme DNMT1 und DNMT3b inklusive ausgesuchter Spleißvarianten bei ALL-Erstrezidiv und AML-Ersterkrankung im Kindesalter im Vergleich zu gesunden Probanden analysiert und untersucht, inwieweit diese eine prognostische Bedeutung hat. MATERIAL UND METHODEN: Es wurden Tumorzellen von 26 Patienten mit ALL-Erstrezidiv (davon 7 in CCR und 19 mit Folgeereignis) sowie 47 Patienten mit AML-Ersterkrankung (davon 34 in CCR und 13 mit Folgeereignis) im Vergleich mit Leukozyten von 22 gesunden Probanden hinsichtlich der DNMT-Expression untersucht. Nach Aufreinigung der Zellen wurde die RNA isoliert und mittels reverser Transkription in cDNA umgeschrieben; diese wurde durch eine Real-Time-PCR nach Etablierung einer Standardreihe gegen 2 Referenzgene (RpL13a als konstant exprimiertes Gen und PCNA als Proliferationsmarker) quantifiziert. ERGEBNISSE: Die Expression von DNMT1 ist sowohl im ALL- als auch im AML-Kollektiv im Vergleich zum Kontrollkollektiv normalisiert zu RpL13a nicht verändert und normalisiert zu PCNA vermindert. DNMT3b ist im ALL-Kollektiv in Normalisierung gegen RpL13a verstärkt und in Normalisierung gegen PCNA nicht verändert. Im AML-Kollektiv ist DNMT3b gegenüber beiden Referenzgenen verstärkt exprimiert. Der Anteil der Spleißvariante DNMT1’ an der DNMT1-Gesamtexpression liegt in allen Kollektiven konstant bei rund 90%. Die übrigen Spleißvarianten von DNMT1 und DNMT3b wurden nicht in die Analyse einbezogen, da sie nicht in allen Proben nachweisbar waren. DNMT3b4 konnte in rund 70% der ALL- und AML-Proben nachgewiesen werden, jedoch nicht im Kontrollkollektiv. Prognostisch relevante Expressionsunterschiede wurden nicht gefunden. DISKUSSION: Die DNMT1-Expression in ALL- und AML-Zellen ist im Vergleich zum Kontrollkollektiv trotz der verstärkten Proliferationsaktivität nicht verändert. Diese somit vergleichsweise niedrige Expression in leukämischen Zellen ist ein möglicher Faktor für die Hypomethylierung neu synthetisierter DNA. DNMT3b ist in AML- Zellen gegenüber beiden Referenzgenen verstärkt exprimiert. Dies könnte einerseits zur Hypermethylierung von Promotor-Regionen führen, andererseits über Konkurrenz mit DNMT1 ebenfalls zur Hypomethylierung beitragen, beispielsweise durch die Spleißvariante DNMT3b4, der diese Eigenschaft bei anderen Tumoren zugeordnet werden konnte. Möglicherweise stellt die verstärkte Expression ein relevantes Entscheidungskriterium zur Therapie beispielsweise des AML-Erstrezidivs mit DNMT-Inhibitoren sein, deren Wirkung vor allem über Enzyme der DNMT3-Familie entfaltet wird. In dieser Arbeit konnte somit eine gegenüber physiologischen Verhältnissen deutlich aberrante Expression der DNA- Methyltransferasen bei ALL und AML im Kindesalter festgestellt werden.
INTRODUCTION AND AIM OF STUDY: The DNA methyltransferases DNMT1, DNMT3a, and DNMT3b catalyze DNA methylation. This leads to compression and inactivation of the methylated DNA region via complex epigenetic mechanisms. Under physiological conditions, the genome is globally hypermethylated, whereas gene promoters tend to be hypomethylated. In tumorigenesis these promoters, especially those of tumor-suppressor-genes, often undergo methylation and consecutive inactivation, while the rest of the genome is aberrantly hypomethylated. Promoter hypermethylation is shown to correlate with increased DNMT expression in some tumors. Promoter hypermethylation could be partially reversed by DNMT inhibitors in Phase I - III studies. DNMT expression has not yet been analyzed in pediatric AML and relapse of ALL. In this study, the expression of DNMT1 and DNMT3b (the DNMTs which are considered to be mainly responsible for aberrant methylation in tumor cells) and the expression of selected isoforms was analyzed in newly diagnosed pediatric AML and relapse of pediatric ALL. The expression was compared to that in healthy subjects. Furthermore, the prognostic role of DNMT expression was examined. MATERIAL AND METHODS: The DNMT expression in tumor cells of 26 patients with first relapse of pediatric ALL (7patients in CCR and 19 patients with subsequent event) and 47 patients with newly diagnosed pediatric AML (34 patients in CCR and 13 patients with subsequent event) was examined and compared to the expression in leukocytes of 22 healthy subjects. After cell filtration RNA was isolated and reversely transcribed into cDNA, which was quantified by Real-Time-PCR after establishment of standard curves and normalized with 2 reference genes (RpL13a served as a stably expressed gene and PCNA as a proliferation marker). RESULTS: Expression of DNMT1 is not altered in leukemic cells compared to the control group if normalized with RpL13a, whereas it is decreased if normalized with PCNA. Expression of DNMT3b is increased in ALL if normalized with RpL13a but not altered if normalized with PCNA. In AML cells, DNMT3b expression is increased after normalization with both reference genes. The isoform DNMT1’ accounts for 90% of the entire DNMT1 expression in all groups. All other isoforms were not included into the statistical analysis since they were not detectable in all of the samples. DNMT3b4 was detected in 70% of the samples of the ALL- and AML-group, respectively, whereas it was not detected in the control group. No differences were found between the subgroups with different outcome. DISCUSSION: Expression of DNMT1 is not altered in the examined leukemic cells compared to the control group despite the elevated level of proliferation. This relatively low level of expression in leukemic cells might contribute to the hypomethylation of newly synthesized DNA. DNMT3b expression is elevated in AML-cells after normalization with both reference genes. This might lead to aberrant hypermethylation of promoter regions as well as to hypomethylation by DNMT3b4 via competition with DNMT1, which has been shown in other entities. The elevated expression might be a relevant parameter to identify AML patients who could profit from DNMT-inhibitor-therapy, since the effects of DNMT inhibitors are mainly developed via DNMT3-enzymes. In conclusion, a distinct aberration of DNMT expression in pediatric AML and ALL was found in this study.
