Als Ergänzungsmethode zum Tierversuch ist die isolierte Organperfusion ein wichtiges Modell, um im Bereich der Grundlagenforschung, der Toxikologie und Pharmakologie sowie in der Transplantationsmedizin verschiedenste Fragestellungen in vitro untersuchen zu können. Der Darm, als ein Hauptorgan zur Aufnahme körperfremder Substanzen, ist mit seinen komplexen Resorptionsvorgängen wie auch seiner Beteiligung an einer Sepsis, aufgrund seiner Anfälligkeit bezüglich eines Ischämie-Reperfusionsschadens, ein bedeutendes Forschungsobjekt. Um physiologische und pathologische Mechanismen am Darm singulär untersuchen zu können, wurde in vorliegender Arbeit eine etablierte Perfusionsapparatur für die isolierte Darmperfusion modifiziert und standardisiert. Ziel der Studie war eine dreistündige Perfusion der Darmabschnitte, möglichst ohne Funktionsverlust und histologisch erkennbaren Schaden. Für vorliegende Studie wurde 16 narkotisierten Schweinen ein jeweils 150 cm langes, proximal gelegenes Stück Jejunum entnommen und an ein extrakorporales Kreislaufsystem angeschlossen. Die Zeit der warmen Ischämie wurde mit 12,9 ± 3,6 Minuten möglichst kurz gehalten. Als Perfusionsmedium diente autologes Blut. Im Anschluss an die Organentnahme wurden die Tiere mittels Blutentzug getötet. Das perfundierte Blut war einem ständigen Gasaustausch sowie einer Dialyse unterworfen. Zudem wurde aufgrund der zentralen Denervierung des Darms kontinuierlich eine geringe Menge Noradrenalin mittels Perfusor zugefügt. Die hämodynamischen Parameter konnten permanent abgelesen werden und wurden alle 20 Minuten aufgezeichnet. Der Darm wurde vor und nach der Perfusion gewogen, nach der Perfusion einmal mit und einmal ohne Mesenterium. Nach Beendigung des Versuchs wurden jeweils aus dem proximalen, mittleren und distalen Abschnitt des Jejunums Gewebeproben entnommen (V prox, Vmed, Vdist). Die daraus angefertigten histologischen Schnitte wurden mit zuvor entnommenen Nativgewebeproben (Kprox, Kdist) des nicht perfundierten Jejunums desselben Tieres verglichen. Histologisch beurteilt wurden die Ödematisierung der einzelnen Darmschichten sowie die Integrität der Mukosa. Bei der statistischen Auswertung kam der Wilcoxon- Vorzeichen-Rang Test als nichtparametrischer Test für zwei verbundene Stichproben zum Einsatz. Der Organwiderstand fiel von seinem anfänglich hohen Wert im Median von 0,5 mmHg/ml/100g auf einen Median von 0,26 – 0,34 mmHg/ml/100g im Lauf des Versuches ab. Dies korrelierte mit dem Sauerstoffverbrauch, der tendenziell in den ersten 40 Minuten des Versuches auf einen Median von 88,7 μmol/min/100g anstieg; bei gleichzeitig abnehmendem Organwiderstand. Einzelne Därme erreichten Spitzenwerte von 252 – 291 μmol/min/100g, was sich auch in den Ergebnissen der histologischen Untersuchung in Form einer nahezu unbeschädigten Mukosa wiederspiegelte. Die Integrität und Funktionalität der Darmmukosa zeigte sich auch anhand der beiden signifikanten Anstiege der Glukoseresorption nach Applikation der Maltoselösung und korrelierte mit den histologischen Ergebnissen der perfundierten Därme (Vprox, Vmed, Vdist). Diese zeigten im Vergleich zu den Kontollgruppen (Kprox, Kdist) ohne Schädigung der Mukosa (Score 0) nur eine minimale Abhebung des Schleimhautepithels von der Lamina propria bei intaktem Mikrovillisaum (Score 1). Die Mediane der Laktatwerte lagen während des gesamten Versuchsablaufes bei Werten zwischen 7,4 und 8,5 mg/dl/100g und spiegelten zusammen mit dem Sauerstoff- und Glukoseverbrauch ebenfalls die Vitalität des Organs wider. Die Gewichtuntersuchungen ergaben, dass sich das aus dem Versuch resultierende Ödem vorwiegend im Mesenterium befand (Mediane: Nettogewicht ante perfusionem 160,8 g, Nettogewicht post perfusionem 292,7 g, Nettogewicht post perfusionem nach Abtrennung des Mesentriums 121,5 g). Dies spiegelten auch die histologischen Untersuchungen wider, wobei die Ödematisierung der Serosa in den Kontrollgruppen (Kprox, Kdist) wie auch in den Versuchsgruppen (Vprox, Vmed, Vdist) im Median einem geringradigen Ödem entsprach (Score1) und bereits intraoperativ entstanden war. Die Tunica muscularis wies nach Beendigung des Versuches in den Gruppen Vmed und Vprox sogar eine geringere Ödematisierung auf (Median Score 0,5) als in den beiden Kontrollgruppen Kprox und Kdist (Median Score 1). Auch der Ödematisierungsgrad des Tela submucosa war ausschließlich in der Vdist Gruppe mit einem Median von Score 1,25 gegenüber den Kontrollgruppen Kprox und Kdist mit einem Median von Score 1 erhöht und stand somit ebenfalls nicht im Zusammenhang mit der durchgeführten Perfusion. Da die Ödeme ausschließlich perivaskulär auftraten, ist anzunehmen, dass die Ödemflüssigkeit vornehmlich aus den nicht kanülierten Lymphgefäßen ausgetreten war. Die Tunica mucosa zeigte bei den Kontrollgruppen Kprox und Kdist eine Ödemausprägung im Median von Score 0 und Score 0,5, die sich während der Perfusion ebenfalls nicht verschlechterte (Mediane: Vprox Score 0, Vmed Score 0, Vdist Score 0,5). Das hier etablierte, isoliert hämoperfundierte Jejunummodell stellt eine vielversprechende Basis für eine Vielzahl weiterer Untersuchungen zu intestinalen Resorptionsvorgängen sowie für Fragestellungen zum Ischämie-Reperfusionsschaden insbesondere in der Transplantationsmedizin dar.
The isolated organ perfusion is an important method to support in vitro investigations regarding fundamental research, toxicology and pharmacology as well as transplantation when looking for a supplemental procedure to bioassays. Being the main organ of the body to absorb foreign substances, the intestine becomes an important research object. Besides being the site of complex resorption procedures, it is also involved in sepsis due to it`s vulnerability in terms of an ischemia - reperfusion injury. In order to study unique physiological and pathological mechanisms of the intestine an established perfusion equipment has been modified and standardised for this study. The aim of the study was a three-hour perfusion of intestinal segments as possible without loss of function and histologically visible damage. For the present study, from 16 anesthetized pigs sections of its proximal jejunum of 150 cm length were extracted and connected to an extracorporal circulatory system. The period of warm ischemia was kept as short as possible with 12.9 ± 3.6 minutes. Blood was used as autologous perfusion medium. The animals were sacrificed by exsanguination immediately following organ removal. Due to the central denervation of the intestine small amounts of norepinephrine were added continuously with a syringe pump. The hemodynamic parameters could be read continuously and were recorded every 20 minutes. The intestine was weighed before and after the perfusion period; the post weighing was done with and without mesenterium. After termination of the experiment tissue samples from the proximal, middle and distal section of the jejunum (Vprox, Vmed, Vdist) were taken for histological evaluation. These were compared to native tissue samples of the jejunum (Kprox, Kdist) of the same animal which had not been perfused and were taken beforehand. Histological evaluation was performed regarding edemas of the intestine sections as well as the integrity of mucosa. To achieve statistic data, Wilcoxon test as non-parametrical method was chosen for two related random samples. The organ resistance declined from its initially high value at a median of 0.5 mmHg/ml/100g to a median value with ranges from 0.26 to 0.34 mmHg/ml/100g in the course of the experiment. This was correlated to oxygen consumption which in tendency increased within the first 40 minutes of the experiment to a median of 88,7 μmol/min/100g with decreasing organ resistance at the same time. Individual intestines reached peak values of 252 - 291 μmol/min/100g which was reflected in form of an almost undamaged mucosa in the results of the histological evaluation. The integrity and functionality of the intestine mucosa also showed up in the two significant increases of the glucose absorption after an application of the maltose solution and correlates to the histological results of the perfused intestines (Vprox, Vmed, Vdist) which in comparison to the control groups (Kprox, Kdist) - without damage of the mucosa (Score 0) - only showed a minimal lifting of the mucosa ephitelium from the lamina propria, by intact brushborder (Score 1). During the course of the essay the median of the lactate values ranged between 7,4 und 8,5 mg/dl/100g. In combination with the consumption of oxygen and glucose these values do also mirror the vitality of the organs. The weight examinations showed that the resulting edema was located predominantly in the mesentery (median: net weight ante perfusionem 160,8 g, net weight post perfusionem 292,7 g, net weight post perfusionem after separation of the mesentery 121,5 g). This was also reflected in the histological studies where it was found that the formation of edema of the serosa in the control groups (Kprox, Kdist) as well as in the experimental groups (Vprox, Vmed, Vdist) in median corresponded to a low level edema (score 1) and had already occurred intraoperatively. After termination of the experiment the tunica muscularis in the groups Vmed and Vprox showed an even lower formation of edema (median score 0,5) than the two control groups Kprox and Kdist (medan score 2). In addition the level of edema formation of the tela submucosa was exclusively increased in the group Vdist with a median score of 1,25 in opposition to the control groups Kprox and Kdist with a median score of 1; hence this also showed no conjunction to the executed perfusion. Since edemas occur solely perivascular it can be assumed that the fluidity of the edema especially has leaked from the non cannulated lymphatic vessels. In the control groups Kprox and Kdist, the tunica mucosa showed an edema with a median score of 0 and 0,5 and did not deteriorate because of the perfusion (Mediane: Vprox Score 0, Vmed Score 0, Vdist Score 0,5). The haemoperfused jejenum-modell established hereby is a promising basis for further research regarding intestinal resorption procedures as well as for questions concerning ischaemia- reperfusion damage particularly in terms of organ transplantation.
