Das Schädel-Hirn-Trauma gehört zu den häufigsten Todesursachen und führt zu lebenslangen neurologischen Beeinträchtigungen in der jungen Population. Es trägt ebenfalls wesentlich zur Mortalität der Patienten über 75 Jahre bei. Die Inzidenz des Schädel-Hirn-Traumas beträgt je nach Schweregrad zwischen 33 und 337/100 000. Die Mortalität in Deutschland als Folge des SHT erreichte im Jahr 2000 9/100 000. Die Behandlung der Verletzten und die oft folgende Arbeitsunfähigkeit verursachen hohe Kosten. Die schlechte Prognose für die Patienten, die ein initiales Trauma überleben, hängt vor allem von sogenannten sekundären Hirnschäden ab. Die Pathophysiologie dieser Prozesse ist sehr komplex und vielfältig. Durch Hypoxie, Hypotonie und Blut-Hirn-Schranken Störung kommt es zu einer intrakraniellen Aktivierung von Komplement, einer Leukozyteninfiltration, der Ausschüttung von proinflammatorischen Zytokinen, Anaphylatoxinen und der Freisetzung von freien Radikalen. Die toxische und proinflammatorische Wirkung dieser Substanzen führt einerseits zur Steigerung des Hirndruckes, somit zum Abfall des zerebralen Perfusionsdruckes und Vertiefung der Hypoxie des Zentralnervensystems, andererseits zur weiteren Beeinträchtigung der Funktion der Blut-Hirn-Schranke, der Endothelzellen, zu Apoptose und Nekrose der Neurone. Die Neuroinflammation nach Schädel-Hirn- Trauma wird somit verstärkt. Zurzeit gibt es keine kausale Therapie der sekundären Hirnschäden nach SHT. Randomisierte, multizentrische Studien zeigten keine vielversprechenden Ergebnisse, haben aber zusammen mit den experimentellen Daten Hinweise darauf gegeben, dass eher die gezielte Unterbrechung des neuroinflammatorischen circulus vitiosus als die Paninhibition der Neuroinflammation zum Erfolg führen kann. Sowohl experimentelle als auch klinische Daten weisen auf die Rolle des Komplementsystems, insbesondere des alternativen Aktivierungsweges, als Verstärker der Neuroinflammation nach SHT hin. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Wirksamkeit der pharmakologischen Blockade des alternativen Komplementaktivierungsweges mittels des spezifischen Anti-Faktor B Antikörpers mAb 1379 nach experimentellem SHT bei C57BL/6 Wildtypmäusen. Die Tiere wurden in vier Gruppen, mit und ohne Trauma sowie mit und ohne Behandlung aufgeteilt. Das klinische Outcome wurde mittels NSS 1h, 4h, 24h und 7d nach dem Trauma erhoben. Zusätzlich wurden zu den Zeitpunkten 4h, 24h und 7d molekularbiologische und immunhistochemische Analysen vorgenommen. Zur Darstellung der Apoptose nach SHT wurde TUNEL angewandt. Real time RT-PCR wurde zur Messung der Expression der pro- und antiapoptotischen Gene Bax, Fas, Fas-L und Bcl-2 im Gehirn eingesetzt. Weiterhin wurde die Expression von Komplementregulatoren wie C1-Inh, CD55 und CD59 und von Zytokinen IL-6, IL-18 bestimmt. Immunhistochemisch wurde die Leukozyteninfiltration sowie die Mikroarchitektur des Gehirns untersucht. Es wurde angenommen, dass eine Behandlung mit dem mAb 1379 Antikörper zu einem besseren klinischen Outcome nach SHT sowie der Reduktion der Apoptose und sekundärer Hirnschäden führt. Weiterhin besteht die Vermutung, dass eine Faktor B Blockade die Hochregulation der protektiven Gene sowie Unterregulation der proapoptotischen Gene und proinflammatorischen Zytokine bewirken kann. Die Aktivität des alternativen Schenkels des Komplementsystems wurde zu den Zeitpunkten 4h und 24h in den mit mAb 1379 behandelten Tieren signifikant inhibiert. Die Tiere, die dem experimentellen SHT unterzogen wurden, haben gegenüber den nicht traumatisierten Tieren ein signifikant schlechteres neurologisches Outcome. Die Wirksamkeit des mAb 1379 Antikörpers konnte im Bezug auf das NSS nicht bewiesen werden. Im Gegensatz zu diesem Ergebnis offenbarte sich eine eindeutige protektive Wirkung vom mAb 1379 in verminderter Apoptoserate bei behandelten Tieren in TUNEL. Die Mikroarchitektur der Gehirne war in dieser Gruppe im Vergleich zu nicht behandelten Tieren geschont. Die real time RT- PCR-Daten ließen erkennen, dass es nach der Injektion von mAb 1379 zu einer Hochregulation der neuroprotektiven Gene Bcl-2, C1-Inh und CD59 kommt. Darüber hinaus zeichnete sich auch eine signifikante Unterregulation von Fas ab. Interessanterweise verursachte die Behandlung mit mAb 1379 eine Hochregulation der Expression von IL-6 und Fas-L. Die Arbeit bestätigte die Haupthypothese nicht, da die Blockade des alternativen Komplementaktivierungsweges ohne signifikante Verbesserung des neurologischen Zustandes blieb. Trotzdem gelang es, einen Nachweis der protektiven Rolle des mAb 1379 in Form der deutlichen Reduktion der Apoptoserate zu erbringen. Die protektive Wirkung spiegelt sich in der Erhöhung der Expression von Bcl-2 und Unterregulation von Fas nach SHT wieder. Die überraschende Hochregulation von IL-6 kann als Folge der kompensatorischen, inflammatorischen Reaktion interpretiert werden. Als Ursache des ausgebliebenen klinischen Effektes der Faktor B Blockade könnte die erwähnte kompensatorische Entzündung und die zu niedrige Dosierung des Antikörpers diskutiert werden. Insgesamt belegen die in der Arbeit präsentierten Daten die neuroprotektive Wirkung vom mAb 1379 sowie die wichtige Rolle des alternativen Komplementaktivierungsweges in der Pathophysiologie des SHT. Gleichzeitig suggerieren die Ergebnisse gewisse molekulare Mechanismen im Verlauf der Neuroinflammation nach SHT, die durch weitere experimentelle Studien geklärt werden müssen.
Traumatic brain injury is one of the most common causes of death and leads to lifelong neurologic impairment in the young population. It also contributes significantly to mortality among patients above 75 years old. The incidence of traumatic brain injury depending on severity accounts between 33 and 337 per 100000. The Mortality in Germany due to traumatic brain injury reached 9 per 100000 in the year 2000. Treatment costs and disability claims generate high costs every year. Of the patients who survive the initial trauma, prognoses are generally poor and depend primarily on the extent of secondary brain damage. The pathophysiology of this process is complex and multifaceted. Hypoxia, hypotension, and blood-brain-barrier disruption induce intracranial complement activation, infiltration and migration of leukocytes, release of pro-inflammatory cytokines, anaphylatoxines, and the formation of free radicals. These pro-inflammatory substances elevate intracranial pressure and therefore decrease cerebral perfusion pressure thereby perpetuating cerebral hypoxia. Moreover, they compromise the function of blood-brain-barrier endothelial cells, resulting in the apoptosis and necrosis of neurons. Currently, there is no known therapy for secondary brain damage after traumatic injury. Although randomized, multicenter studies have thus far not yielded very promising results, they have shown that specific blockade of neuroinflammatory cycle rather than pan-inhibition of immune response may lead to success. Both, experimental and clinical data suggest that the role of complement system, particularly the alternative activation pathway, is that of an “intensifier of neuroinflammation” following traumatic brain injury. The aim of this study was the analysis of the efficacy of pharmacological blockade of the alternative complement activation pathway by neutralizing monoclonal anti-factor B antibody mAb1379 after experimental traumatic brain injury in C57BL/6 mice. The mice were divided into 4 groups—namely, with and without trauma as well with and without treatment. The clinical outcome was assessed using NSS 1h, 4h, 24h and 7d after traumatic impact. Moreover, at time points 4h, 24h, and 7d molecular biologic and immunohistochemical analyses were conducted. To assess apoptosis following traumatic brain injury, TUNEL was used. Real time RT-PCR was applied to measure the expressions of pro- and anti-apoptotic genes: Bax, Fas, Fas-L, and Bcl-2 in the brain. Furthermore, the expression of regulators of complement like C1-Inh, CD55, CD59, and the cytokines IL-6 and IL-18 were analyzed. Immunohistochemical methods were used to show infiltration of leukocytes and the microarchitecture of brains. We hypothesized that treatment with mAb1379 improves clinical outcome following traumatic brain injury and diminishes secondary brain damage and the rate of apoptosis. Moreover, we hypothesized that blocking faktor B would lead to the up-regulation of protective and down-regulation of pro-apoptotic genes and pro-inflammatory cytokines. The activity of alternative complement pathway was significantly reduced at 4h and 24h time points in the animals treated with mAb1379. Mice that underwent experimental traumatic brain injury showed significantly worse outcome compared to animals without trauma. The efficacy of mAb1379 regarding NSS outcome scale could not be demonstrated. In contrast to this result, protective effects caused by mAb1379 were showed in reduction of rate of apoptosis in TUNEL analysis. The microarchitecture of brains in treated mice was much more preserved in comparison with untreated animals. Real time RT-PCR analyses showed that injection of mAb1379 promoted the up- regulation of neuroprotective genes Bcl-2, C1-Inh, and CD59. Moreover, pro- apoptotic Fas was down-regulated. Interestingly, the experiment also revealed that mAb1379 treatment lead to the increased of IL-6 and Fas-L expression. The main hypothesis of this study was rejected, as blockade of the alternative complement pathway activity did not result in improved neurological outcome. Nevertheless, the study showed evidence for the protective role of mAb1379 by way of significant reduction of apoptosis rates. The treatment also resulted in the up-regulation of Bcl-2 and down-regulation of Fas following traumatic brain injury. The surprising up-regulation of IL-6 could be interpreted as a consequence of a compensatory inflammatory response. Therefore, lack of clinical improvement after factor B blockade may be due to compensatory inflammation or under-dosing the antibody. The data presented in this study show that mAb1379 has neuroprotective effects and the crucial role of alternative complement pathway activity in the pathophysiology of traumatic brain injury. Moreover, these results illuminate some interesting molecular mechanisms in the course of neuroinflammation following traumatic brain injury, which should be investigated in further studies.
