In der vorliegenden Arbeit wurden neue Methoden der Hochfeld-EPR bei 360 GHz/ 12.8 T entwickelt sowie bisher aus apparativen Gründen nicht durchführbare EPR-Experimente bei 95 GHz(W-Band), 180 GHz(G-Band) und 360 GHz auf Probleme der Proteinforschung angewandt. Um g-Tensoren von Radikalen in nur in kleinen Mengen verfügbaren Proteinen mit hoher Empfindlichkeit und spektraler Auflösung messen zu können, wurde das an der FU-Berlin aufgebaute 360-GHz-cw- EPR-Spektrometer überarbeitet und erweitert. Die Empfindlichkeit des Spektrometers konnte um den Faktor fünf erhöht und die Langzeitstabilität während der Messung auf mehrere Stunden gesteigert werden. In den Resonator wurde zusätzlich eine Lichtankopplung eingebaut, die die Beleuchtung gefrorener Lösungen im Resonator erlaubt. Durch die Konstruktion einer neuen quasi-optischen Mikrowellenbrücke ist nun die phasenempfindliche Detektion transienter Signale möglich. Neben der Optimierung des cw-Spektrometers wurde das erste 360-GHz-EPR-Spektrometer mit gepulster Mikrowellenanregung durch ein Orotron aufgebaut. Um die für gepulste EPR-Experimente notwendigen Anforderungen zu erfüllen, musste der Prototyp des Orotrons spezifiziert, optimiert und in eine neue Mikrowellenbrücke integriert werden. Mit dieser Konfiguration des Spektrometers konnten erste gepulste Messungen bei 360 GHz an einer Testprobe durchgeführt werden. Durch Hochfeld-EPR-Untersuchungen bei 360 GHz am primären Elektronendonor P+· in Mutanten von Rb. sphaeroides gelang es, die Hauptwerte des g-Tensors in der HE(M202)-Mutante erstmals sowie die g -Tensor-Hauptwerte der Mutanten HL(M202) und R26 mit erhöhter Genauigkeit zu bestimmen. Abhängig von der Mutation wurden Verschiebungen der Hauptwerte gxx und gzz beobachtet. Mit Hilfe von Dichtefunktionaltheorierechnungen konnte eine Korrelation zwischen der Drehung der Acetylgruppe der BChl(L)-Dimerhälfte mit der Verschiebung von gzz hergestellt werden. Die hohe spektrale Auflösung der 360-GHz-EPR erlaubte auch erstmals die vollständige Auflösung der g -Tensor-Hauptwerte von FADH· im EPR-Spektrum. Die Hauptwerte gxx = 2.00431(5), gyy = 2.00360(5) und gzz =2.00217(7) wurden durch Simulationen aus den Hochfeld-EPR-Spektren gewonnen. Zusätzlich konnte durch eine Kombination von Hochfeld-EPR und ENDOR-Methoden die Orientierung des g-Tensors zum Molekülachsensystem bestimmt werden. Orientierungsselektive 'Davies'-ENDOR- Messungen im W-Band zeigten, dass die gzz-Komponente senkrecht zur Ebene des Flavinmoleküls steht. Die Orientierung der gxx- und gyy-Komponente in der Molekülebene wurde durch einen Vergleich der 360-GHz-Spektren von deuterierten und protonierten Proben bestimmt. In einer Untersuchung der inter- und intramolekularen Dynamik von QA-· und QB-· in Reaktionszentren von Rb. sphaeroides wurde die zeitabhängige Modulation des effektiven g-Werts der Chinone als Sonde der Bewegung benutzt. Mit Hilfe von zwei-dimensionaler ESE- detektierter W-Band-EPR wurde die Orientierungsabhängigkeit der Spin-Spin- Relaxationszeit T2 ermittelt. Auf Grund der Temperaturabhängigkeit der Relaxation konnten zwei verschiedene Bewegungsmoden postuliert werden, die die Relaxation bei unterschiedlichen Temperaturen dominieren. Messungen an QA-· im G-Band zeigten keine quadratische Feldabhängigkeit der Relaxation. Dieser Befund deutet darauf hin, dass sich die beobachteten Bewegungen im slow motion limit vollziehen.
In the presented work new high-field EPR methods at 360 GHz/12.8 T have been developed and EPR-experiments at 95 GHz(W-band), 180 GHz(G-band) and 360 GHz have been applied to problems in protein research which - until now - have not been feasible due to technical restrictions. To resolve the g-tensors of radicals in protein samples which are only available in very small amounts with high sensitivity and resolution, the 360-GHz cw EPR spectrometer at the FU-Berlin had to be optimized. Elimination of standing waves in the spectrometer and an increased quality factor of the EPR resonator lead to a five-fold increase of the spectrometer sensitivity and made EPR measurements of several hours duration possible. In addition, the resonator was fitted with a light fiber which enabled light-application to the frozen sample in the EPR resonator. With the construction of a new microwave detection scheme, the phase-sensitive detection of transient signals is now possible. Apart from the optimisation of our cw-spectrometer, one of the main goals of this work was the construction of the first pulsed 360 GHz EPR spectrometer with an orotron as microwave source. In order to fulfill the necessary specifications for pulsed EPR experiments, the prototype of the orotron had to be optimized and specified. After the integration of the orotron into a new microwave bridge first pulsed EPR experiments at 360 GHz could be performed on a test sample. High-field EPR measurements on the primary electron donor P+· in different mutants of Rb. sphaeroides made it possible for the first time to determine the g-tensor values of HE(M202) and to measure gxx, gyy and gzz of HL(M202) and R26 with enhanced precision. As a result of the mutation pronounced shifts of the g-tensor values gxx and gzz could be observed. With the aid of density functional theory calculations the shift of the gzz-component could be attributed to a turn of the acetyl-group of the BChl(L) dimer half. Due to the high spectral resolution of EPR experiments at 360 GHz the g-tensor values of FADH· could be fully resolved in the EPR spectrum for the first time. The canonical values of the g-tensor gxx = 2.00431(5), gyy = 2.00360(5) and gzz =2.00217(7) have been obtained from simulations of the high-field EPR spectrum. Additionally, the orientation of the g-tensor components with respect to the axis system of the molecule could be revealed by a combination of high-field EPR and ENDOR experiments. Orientation selective ENDOR experiments in W-band showed that the gzz-component is perpendicular to the molecular plane of the flavin molecule. The orientation of the gxx- and gyy- component in the plane was found by a comparison between 360 GHz EPR spectra of deuterated and protonated samples. In an investigation of inter- and intramolecular dynamics of QA-· and QB-· in reaction centers of Rb. sphaeroides the modulation of the effective g-value was used as a probe of the motion. By means of two-dimensional ESE detected W-band-EPR the orientational dependence of the spin-spin-relaxation time T2 was determined. From the temperature dependence of the relaxation two motional modes could be postulated which dominate the motion at different temperatures. G-band measurements on QA-· showed no quadratic dependence of the relaxation times on the external magnetic field, which is an indication for the fact that the motion takes place in the slow motion limit.
