Die photosynthetische Wasseroxidation des Mn4Ca-Komplexes im Photosystem II (PSII) ist für die Atmosphäre und das Leben auf der Erde von fundamentaler Bedeutung. Jedoch ist dieser Prozess nur unzureichend verstanden. Mit Hilfe von Röntgenabsorptionsspektroskopie (X-ray Absorption Spectroscopy, XAS) zur Untersuchung der Struktur des Mn4Ca-Komplexes und insbesondere der strukturellen Veränderungen im katalytischen Zyklus wurden wichtige Resultate erzielt um den Mechanismus der photosynthetischen Wasseroxidation zu enträtseln. In der hier vorliegenden Arbeit werden zwei spezielle Beiträge dazu vorgestellt. 1\. Raumtemperatur- und zeitaufgelöste XAS-Messungen zu Intermediatzuständen des katalytischen Zyklus Durch präparative Untersuchungen konnte in PSII-Membranfragmenten ein minimaler Wassergehalt auf 50 Gewichts-% erzielt werden, der für ein optimales Signal-zu-Rausch-Verhältnis erforderlich ist. Durch die Nutzung eines elektronischen Dosiersystems konnte außerdem die automatisierte, schnelle und reproduzierbare Auftragung von PSII-Suspension auf einen speziell entworfenen Probenträger erreicht werden. Ferner wurde eine Apparatur für den automatisierten Probenwechsel während der XAS-Messungen entwickelt. Damit war es möglich, einzelne Proben mit Laserblitzsequenzen zu belichten und simultan XAS-Daten aufzunehmen. Nur mit der Hilfe dieser verbesserten Methodik wurde eine Reihe von Untersuchungen am katalytischen Zyklus des PSII-Komplexes möglich. Dadurch konnten Geschwindigkeitskonstanten und Temperaturabhängigkeit der durch Röntgenstrahlung induzierten Photoreduktion des Mn4Ca-Komplexes ermittelt werden. Außerdem wurde zum ersten Mal die Struktur und die Oxidationszustände des Mn4Ca-Komplexes bei Raumtemperatur (funktionale und quasi-native Bedingungen) für alle vier semistabilen Intermediatzustände charakterisiert und mit Daten, die bei 20 K ermittelt wurden, verglichen. Die zeitaufgelösten XAS-Messungen mit einer Auflösung von 10 μs ermöglichten die Entdeckung und Identifizierung eines neuen Reaktionszwischenzustandes. Diese Ergebnisse führten zu einer Erweiterung des fundamentalen S-Zyklus und sind von wesentlicher Bedeutung für den Entwicklung mechanistischer Modelle zur photosynthetischen Wasseroxidation. 2\. XAS an der Ca-K-Kante zur Bestimmung der Position und der Koordination von Calcium Durch die Optimierung der Prozedur zur Entfernung von überschüssigen Calcium konnte der Ca2+-Gehalt auf weniger als 2 - 3 Ca/PSII reduzieren werden, ohne signifikanten Verlust der Sauerstoffaktivität. Trotz der experimentellen Schwierigkeiten konnten Ca-XAS-Spektren aufgenommen und analysiert werden, und zwar für PSII-Proben im S1-Zustand. Es wurden außerdem erste Versuche zur Charakterisierung des S2-Zustandes unternommen. Es zeigte sich, dass das Ca2+-Ion sich ein einem Abstand von ca. 3,3 Å zu mindestens einem Manganatom befindet. Dieses Ergebnis ist in guter Übereinstimmung mit den neusten kristallographischen Daten und mit den XAS-Ergebnissen aus anderen Gruppen.
Photosynthetic water oxidation at the Mn4Ca-cluster of Photosystem II (PSII), a process of fundamental importance for the atmosphere and biosphere on the earth, is only insuffciently understood. X-ray absorption spectroscopy (XAS) on the structure of the Mn4Ca-cluster and, in particular, on the structural changes in the catalytic cycle has resulted in central contributions to unravel the mechanism of photosynthetic water oxidation. In the presented thesis two specific contributions are described. 1\. Room-temperature and time-resolved XAS on intermediates in the catalytic cycle Through preperative investigations a minimal water content of PSII membrane particles could possible down to 50 % (weight per weight). This is requered for an optimal signal-to-noise ratio. Using a electronic dispensing system the automated preparation of PSII samples on specifically designed samples stripes has been achieved. An apparatus for automated sample change during the XAS measurements has been developed that facilitated Laser-flash application and XAS measurements on up to 10,000 PSII samples per beamtime period. Only by means of this improved methodology, a series of investigation on the Mn4Ca-cluster in its catalytic cycle became possible. Thereby the rate and temperature dependence of the X-ray induced reduction of the Mn4Ca-cluster was thoroughly characterized. And for the first time, structure and oxidation state of the Mn4Ca-cluster at room temperature (functional and quasi-native conditions) has been characterized for all four semi-stable intermediate states of the S-state cycle and compared to data collected at 20 K. Time-resolved XAS measurements at 10 μs resolution facilitated discovery and identification of a novel reaction intermediate. The results lead to an extension of the fundamental S-state cycle and bear important mechanistic implications. 2\. XAS at the Ca K-edge on the position of Ca coordination environment By optimization of a procedure for removal of excessive calcium, the Ca2+ content could be reduced down to a level of 2 - 3 Ca per PSII, without significant activity loss. In spite of the experimental difficulties, it became possible to collect and analyze XAS data for PSII samples in the S1-state. First attempts to characterize the S2-state were made. One result is, that the calcium is at a distance of ca. 3.3 Å to more than one manganese ion. This result is in good agreement with recent crystallographic data and with the XAS results of other research groups.
