In vitro optimization of microdialysis for pharmacokinetic applications

Abstract

Quantitative microdialysis of lipophilic compounds has always been problematic in the past. Due to adherence to the membrane and tubing used, observed recoveries are often low, and the time needed to reach steady state variably long. This thesis aims to develop an in vitro set up to test the suitability of these materials for pharmacokinetic applications, and to suggest numerical parameters to describe the observed response to concentration changes. A range of tubing materials and microdialysis probes are tested with a model lipophilic compound (ZK 975, LogPOW = 4) and a model hydrophilic compound (ZK 894, LogPOW = 1.5). Five tubing materials were tested and compared: fluorinated ethylene propylene (FEP), FEP/Teflon, polyethyleneethyleneketone (PEEK), fused silica and silicone. Each material was first 'primed' by flushing with a 5-10 µM test solution for 1 hour, then rinsed by flushing with Ringer's solution for 1 hour, both at 2 µL/min. During the rinsing phase, samples were collected every 3 minutes, and the results presented graphically. From the data, the 'amount eluted' (Ae), or washed out, from the tubing material was evaluated and compared. For the lipophilic compound ZK 975, only fused silica showed no elution and therefore no binding. For ZK 894, FEP, FEP/Teflon and fused silica showed no elution, with PEEK and silicone only eluting minimal amounts. Eleven microdialysis probes for intracranial use were tested and compared. The probes differed in their membrane material (polycarbonate (PC), polyethylenesulfone (PES), polyacrylonitrile (PAN), cuprophane (Cu) or cellulosic (Cell)), membrane pore size (6, 15, 35 or 100 kDa), membrane surface area (3 or 7.5 mm2), membrane thickness (5, 20 or 30 µm) and outlet material (stainless steel or PEEK). Fused silica was used as outlet tubing. Each probe was first immersed in a 1 µM test solution for 1 hour (Phase A), then in Ringer's solution for 1 hour (Rinse B). The same was repeated with a 10 M test solution (Phase B) and a 1 hour rinsing phase (Rinse B). All probes were perfused with Ringer's solution at 2 µL/min, and all experiments were carried out in a water bath set at 37°C, with the medium stirred at maximum setting (1500 rpm). Samples were collected every 6 minutes throughout this 4-hour test. The results were presented graphically, and the recovery and mass transfer coefficient K were calculated. Also, a hypothetical ideal area under the data (iAUD) was calculated for both concentration phases, for a probe that reached steady-state immediately, and had the same mass transfer coefficient K. The actual AUD of the probe tested was related to this iAUD, to obtain the percentage of the iAUD achieved (%iAUD). For the rinsing phases A and B, the amount eluted from the exposed membrane surface was calculated, and related to the total membrane volume. For ZK 975, only probes with cellulosic or cuprophane membranes displayed a %iAUD of > 95% and an Ae of < 5 pmol/mm3. All other materials showed clear delays in response to increasing concentrations (Phase A and B) as reflected by a low %iAUD, and to decreasing concentrations (Rinse A and B) as reflected by a high Ae. For ZK 894, most materials had a %iAUD of > 95% and an Ae of < 5 pmol/mm3. Only the PC-membrane showed considerable bleeding during the rinsing phases, and the PAN-membrane behaved differently at the two concentrations tested. It is concluded that the presented method and parameters are useful in testing and describing the suitability of tubing and microdialysis probe materials for pharmacokinetic applications. Materials are identified that allow quantitative microdialysis of the lipophilic compound (fused silica tubing and cellulosic or cuprophane membranes). It is also shown that even for a hydrophilic compound, not all materials lend themselves for microdialysis, confirming the importance of always testing microdialysis materials for quantitative studies in vitro, in an experimental setting representative of the pharmacokinetic study to be carried out in vivo.

Einleitung Die Mikrodialyse wurde ursprünglich in der Neuropharmakologie, zur Messung von Neurotransmitter entwickelt (Ungerstedt, Herrera-Marschitz et al., 1982). Seit 1990 wurde die Mikrodialyse auch für pharmakokinetische Untersuchungen exogener Substanzen eingesetzt (Ståhle, Segersvärd et al., 1990). Problematisch sind hierbei lipophile Substanzen, die an der Sondenmembran und am Schlauch haften. Die Mikrodialyse dieser Substanzen ist mit niedrigen Wiederfindungen (Carneheim and Ståhle, 1991) und langen Equilibrationszeiten verbunden. Die genaue Equilibrationszeit wird aber selten berichtet (Tao and Hjorth, 1992), dabei ist eine kurze Equilibrationszeit wichtig, wenn schnelle Konzentrationsänderungen gemessen werden sollen. Diese Dissertation hat daher zum Ziel ein Testverfahren zu etablieren, welches die Substanzbindung am eingesetzten Material, und die Reaktionszeit des Mikrodialyseaufbaus auf Konzentrationsänderungen quantitativ erfassen kann, damit Schlauch- und Sondenmaterialien identifiziert werden können, die für pharmakokinetische Anwendungen geeignet sind. Materialien Ein Material, dass für pharmakokinetische Studien eingesetzt werden soll, muss schnell auf Konzentrationsänderungen reagieren, und muss eine genügende Wiederfindung haben, damit die Substanzkonzentrationen in den gesammelten Proben ausreichen, um mit dem vorhandenen analytischen Verfahren quantifiziert werden zu können. Die Materialien sollten daher keine Bindung mit der Testsubstanz eingehen. Um dies zu belegen, werden Schläuche und Sonden getrennt getestet, denn nur wenn der Sammelschlauch (= Outlet) die Substanz nicht bindet, kann die Adhäsion am Sondenmaterial gemessen werden. Für die Dissertation waren 5 für die Mikrodialyse geeignete Schlauchmaterialien, und 11 unterschiedliche Hirnsonden im Handel erhältlich (Tabelle 1 und Tabelle 2). Fettgedruckt sind die Eigenschaften der Sonden, die in Bezug auf Bindungskapazität und Reaktionszeit verglichen werden: unterschiedliche Membranmaterialien und gleiches Membranmaterial aber mit unterschiedlicher Porengröße, Membrangröße, Membrandicke oder Outletmaterial. Die für die Mikrodialyse relevanten Eigenschaften der beiden Testsubstanzen sind in Tabelle 3 aufgelistet. ZK 975 ist eine lipophile Substanz, die in Vorversuchen als 'klebrig' erkannt worden war, ZK 894 ist eine hydrophile Substanz, die sich vorher als unproblematisch erwiesen hatte. Methode Für den Schlauchtest wurde jeder Schlauch (N = 4 pro Material) über Nacht mit Ringerlösung vorgespült, was zu reproduzierbareren Ergebnisse führte als mit Schläuchen, die direkt von der Packung für den Test eingesetzt wurden. Der Test bestand aus eine Expositionsphase von zirka einer Stunde, wobei der Schlauch mit einer Lösung von 5-10 µM Substanz in Ringer bei 2 µL/min durchgespült wurde (Figur 1). Am Ende dieser Phase wurde eine Probe entnommen (Probe 0). Anschließend folgte eine 57-Minütige Auswaschphase, wobei die Schläuche mit Ringerlösung gespült wurden, und alle 3 Minuten Proben gesammelt wurden. Für den Sondentest wurden die Materialien (N = 4 pro Sondentyp) ebenfalls über Nacht mit Ringerlösung vorgespült. Der Test am Folgetag bestand aus zwei Konzentrationsphasen (Phase A und Phase B), und zwei Auswaschphasen ('Rinse A' und 'Rinse B'), jeweils 1 Stunde lang, mit Probennahme alle 6 Minuten (Figur 2). Die Flußrate war immer 2 µL/min, die Temperatur war auf 37°C eingestellt, und die Media wurden bei maximaler Einstellung (1500 rpm) gerührt. Auswertung Die Schlauchbefunde wurden grafisch dargestellt als Probenkonzentration in '% der Ausgangskonzentration' gegen 'Anzahl Totvolumenwechsel', wobei jeder Schlauch eine ähnliche innere für die Substanzbindung verfügbare Oberfläche hat (Tabelle 1). Um die Bindungskapazität der Schläuche zu quantifizieren, wurde die 'amount eluted' (Ae), die Menge an eluierter Substanz, berechnet, wobei Ae1-5 die gesamte gesammelte Menge an Substanz in den ersten fünf Totvolumenwechsel (Ae0-5) ist, mit Abzug der noch vorhandenen Substanzmenge im Schlauch am Anfang der Auswaschphase (ATotvolumen). Da die üblicherweise bei Sonden angegebene Wiederfindung (REC) stark von der Membranoberfläche (S) und der Flußrate (Q) abhängt, wurden zum direkten Vergleich die Sondenbefunde grafisch dargestellt als Massenübertragungskoeffizient K (Sun and Stenken, 2003) gegen Probenzahl. Um die Reaktion der Sonde auf ansteigende Konzentrationen numerisch zu beschreiben, wurde für Phasen A und B die Fläche unter der Kurve (AUD) bestimmt, die dann bezogen wurde auf die AUD einer 'idealen' Sonde (iAUD), die sofort auf die Konzentrationsänderung reagiert, und denselben K wie die getestete Sonde hat. Für die Auswaschphase wurde, wie bei den Schläuchen, die Menge der Substanz berechnet die vom Sondenmaterial eluiert wurde (Ae). Da am Anfang der Auswaschphase aber noch Substanzrückstände in der wässrigen Phase in den Poren der Membran in unbekannten Mengen vorhanden sind, wurden die Daten beider Auswaschphase kombiniert um dieses zu berücksichtigen. Ergebnisse Von den Schlauchmaterialien ist nur fused silica geeignet zur Mikrodialyse der lipophilen Substanz ZK 975, da es schnell ausgespült werden kann (Figur 3), und keine Bindung aufweist (Ae = 0 ± 0 pmol/cm2 Mittlewert ± SD). Alle anderen Materialen bluten lange nach (FEP, FEP/Teflon und PEEK, Ae > 45 pmol/cm2), oder werden gar nicht erst in der einstündigen Expositionsphase abgesättigt (Silikon). Für die Mikrodialyse von der hydrophilen Substanz ZK 894 sind sowohl fused silica (Ae = 0 ± 0 pmol/cm2), als auch FEP (Ae = 2.2 ± 0.6 pmol/cm2) und FEP/Teflon (Ae = 0 ± 0 pmol/cm2) als Schlauchmaterial geeignet (Figur 4). Eine leicht verlängerte Auswaschzeit wurde beobachtet für PEEK (Ae = 5.1 ± 4.4 pmol/cm2) und für Silikon (Ae = 4.9 ± 0.8 pmol/cm2), und diese beide Materialien eignen sich daher nur für Messungen konstanter Konzentrationen (z.B. bei Infusionsstudien). Von den Mikrodialysesonden eignen sich alle Cellulose-ähnlichen Membrane (Cuprophan und Cellulosic) für pharmakokinetische Mikrodialysestudien mit sowohl ZK 975 als auch ZK 894 (Figur 5 und Figur 6). Die %iAUD lag immer über 95%, und die Ae immer unter 5 pmol/mm3. Auch die PES-Membrane sind für die quantitative Mikrodialyse von ZK 894 geeignet, für ZK 975 aber eher nicht. Nur bei sehr kleinen Membranoberflächen kann die Bindungskapazität der PES-Membran für ZK 975 auf ein Maß reduziert werden, dass eventuell noch Messungen konstanter Konzentrationen erlaubt (mit 85% < %iAUD < 95%, und einer Ae von zirka 15 pmol/mm3). Die PC-Membran ist für ZK 975 gar nicht, und für ZK 894 nur begrenzt geeignet, und die PAN-Membran ist für keine der beiden Substanzen für pharmakokinetische Fragestellungen geeignet (%iAUD <85%, Ae >5 pmol/mm3). Ein Einfluss der Porengröße auf die Wiederfindung oder auf die Reaktionszeit konnte nicht gefunden werden. Eine scheinbar höhere Massenübertragung (K) bei einer kleineren Membran ist eher zurückzuführen auf unterschiedliche 'fluid layers' (Tabelle 2). Die Membrandicke jedoch hat einen deutlichen Einfluss auf K, wobei eine dünnere Membran erwartungsgemäß eine größere Massenübertragung hat. Das Outletmaterial hat keinen Einfluss auf K oder auf die Reaktionszeit. Schlussfolgerung Die vorgestellten Prüfungsabläufe für Schlauch- und Sondentests eignen sich zur Identifizierung geeigneter Materialien für pharmakokinetische Fragestellungen; Die Parameter Ae (Schläuche und Sonden), und der Parameter %iAUD (Sonden) beschreiben die Reaktion der Materialien auf Konzentrationsänderungen gut; Für die lipophile Substanz ZK 975 eignen sich fused silica Schläuche und Cellulosic- oder Cuprophane-Membrane zur quantitativen Mikrodialyse; Für die hydrophile Substanz ZK 894 eignen sich zusätzlich FEP und FEP/Teflon Schläuche, und PES-Membrane für pharmakokinetische Fragestellungen.