Congenital heart disease (CHD) affects 1.35 million new-borns each year and is the most common birth defect in humans. Thanks to major medical advances, the majority of today’s patients reach adulthood; however, they often suffer from impaired quality of life and long-term complications. Most probably, the majority of cardiac malformations are caused by complex combinations of various genetic, epigenetic and environmental factors. The identification of disease-related genes and variations has been a great challenge and it is complicated by the fact that every healthy human carries hundreds of probably damaging genomic variations that seem to be tolerated in the individual context. In this study, we aimed to unravel the complex genetics of Tetralogy of Fallot, the most common cyanotic form of CHD, and to develop novel methods for the identification of disease-related genes. For a small and homogeneous cohort of well-defined isolated TOF cases, we performed re-sequencing of more than 1,000 genes and microRNAs as well as expression profiling and histological analysis of right ventricular biopsies. Focusing on single nucleotide variations, we developed the novel concept of the gene mutation frequency, which considers all deleterious variations in a gene. We provide strong evidence for the polygenic origin of TOF and identified 16 significantly over-mutated genes. The genes interact in a molecular network that shows expression disturbances shared by genetically similar patients. To identify copy number variations (CNVs) in the TOF samples, we established a novel calling method based on outlier detection that is applicable to small cohorts and thus is of special interest for the analysis of families, trios and rare diseases. In the TOF patients, we identified four copy number gains affecting three genes, of which two are important regulators of heart development. Finally, we provide a roadmap for the application of next- generation sequencing to the genetic analysis of congenital cardiac malformations. We discuss aspects of study design, platform selection, available tools and control datasets. Moreover, we give an overview of current NGS studies on heart malformations. Taken together, we developed novel methods to analyse the complex genetics of congenital heart disease and analysed the polygenic origin of Tetralogy of Fallot. This will hopefully enhance our understanding of heart development and the aetiology of CHD and help to develop novel preventive and therapeutic strategies.
Angeborene Herzfehler (AHF) sind die häufigste angeborene Fehlbildung beim Menschen und betreffen jährlich etwa 1,35 Millionen Neugeborene. Dank großer medizinischer Fortschritte erreicht heute die Mehrzahl der Betroffenen das Erwachsenenalter, sie leiden jedoch oft unter einer eingeschränkten Lebensqualität und langfristigen Komplikationen. Die meisten Herzfehler werden höchstwahrscheinlich durch komplexe Kombinationen von genetischen und epigenetischen Faktoren sowie Umwelteinflüssen ausgelöst. Bisher war die Bestimmung von Krankheits-assoziierten Genen und Mutationen eine große Herausforderung und wird noch dadurch erschwert, dass jeder gesunde Mensch hunderte von potentiell schädlichen genetischen Variationen trägt, die im individuellen Kontext toleriert werden. Ziel dieser Studie war es, die komplexen genetischen Hintergründe der Fallot’schen Tetralogie (Tetralogy of Fallot, TOF), dem häufigsten zyanotischen AHF, aufzuklären. Dabei wurden neue Methoden für die Identifizierung von krankheitsrelevanten Genen entwickelt. Für eine kleine Kohorte von gut definierten, nicht-syndromischen TOF-Patienten wurden Re-Sequenzierungen von über 1000 Genen und microRNAs sowie Expressionsanalysen und histologische Untersuchungen an Biopsien des rechten Ventrikels durchgeführt. Für die Analyse von Einzelnukleotid-Variationen wurde das Konzept der Genmutationsfrequenz entwickelt, das alle schädlichen Variationen in einem Gen betrachtet. In der TOF-Kohorte führte dies zur Identifikation von 16 signifikant übermutierten Genen und unterstützt damit einen polygenen Hintergrund der Erkrankung. Die Gene interagieren in einem molekularen Netzwerk, das gemeinsame Expressionsveränderungen in genetisch ähnlichen Patienten zeigt. Für die Suche nach Kopienzahlvariationen (copy number variations, CNVs) in den TOF-Patienten wurde eine neue Methode entwickelt, die auf der Identifizierung von Ausreißern beruht und auf kleine Kohorten angewendet werden kann. Damit ist sie besonders interessant für die Analyse von Familien, Trios und seltenen Erkrankungen. In den TOF-Patienten wurden vier Regionen mit erhöhter Kopienzahl in drei Genen identifiziert, von denen zwei wichtige Regulatoren der Herzentwicklung darstellen. Abschließend werden in einer Übersicht die Möglichkeiten der Next-Generation Sequenzierung (NGS) für die genetische Untersuchung von angeborenen Herzfehlbildungen vorgestellt. Dafür werden Aspekte des Studiendesigns, der Auswahl der Sequenzierungs-Plattform sowie verfügbare Programme und Kontroll-Datensätze diskutiert. Darüber hinaus werden aktuelle NGS-Studien an Herzfehlbildungen vorgestellt. Zusammengefasst wurden in dieser Arbeit neue Methoden zur Analyse der komplexen Genetik angeborener Herzfehler entwickelt und der polygene Ursprung der Fallot’schen Tetralogie untersucht. Dies wird hoffentlich das Verständnis der Herzentwicklung und der Ätiologie von AHF verbessern und zur Entwicklung neuer Präventionsmaßnahmen und Therapien beitragen.
