Die Bluthirnschranke (BBB) spielt eine entscheidende Rolle in der Regulation der zerebralen Mikroumgebung. Die physiologischen Mechanismen der BBB bzw. deren Änderungen während pathologischer Zustände sind bis heute unzureichend bekannt. In dieser Arbeit verwendete ich Natriumdehydrocholat (DHC) auf der Kortexoberfläche von Ratten in einem Modell der kranialen Fensterung, um die BBB zu öffnen. Dabei war ich insbesondere daran interessiert, ob die BBB- Öffnung durch DHC zu Spreading Depolarization (SD) führt, denn (i) Endothelin-1(1−21) (ET-1), welches sehr potent SD auslöst, ist bereits für seine Unterbrechung der BBB bekannt, und zudem (ii) wurde kürzlich vermutet, dass ET-1 SD durch eine BBB-Öffnung hervorruft. SD ist durch eine massive Ionenverschiebung zwischen Intra- und Extrazellulärraum der Neurone sowie durch eine fast vollständige anhaltende Depolarisation der Nervenzellen charakterisiert, welche mit dem Erliegen der elektrischen Hirnaktivität (Spreading Depression), einer neuronalen Schwellung und einer großen negativen Veränderung des Gleichstrom (direct current; DC) -Potenzials einhergeht. Seit Kurzem gibt es auch in der Klinik eindeutige elektrophysiologische Nachweise dafür, dass multiple SDs während Hirntraumata und Schlaganfällen auftreten und vermutlich Nervenschädigung begünstigen, ähnlich wie auch BBB-Unterbrechungen für solche Schäden verantwortlich gemacht werden. Nach intravenöser Evans- Blue-Applikation und mithilfe eines neu entwickelten semi-quantitativen Auswertungsprogramms in Matlab®, konnte ich bestätigen, dass DHC die BBB für das Makromolekül Albumin öffnet. Trotz des signifikanten Nachweises der BBB- Öffnung durch DHC konnte ich mit kaliumselektiven Mikroelektroden und Laser- Doppler-Blutflussmessungen keine SDs detektieren. Weiterhin konnte ich keine Hinweise auf einen extrazellulären Kaliumanstieg nach DHC-Gabe beobachten, obwohl es bekannt ist, dass ein Kaliumkonzentrationsgefälle zwischen dem intra- und dem extrazellulären Kompartiment besteht. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die BBB unter pathologischen Bedingungen gleichzeitig durchlässig für Makromoleküle wie Albumin aber unpassierbar für kleine Moleküle, wie Kalium sein kann. Eine mögliche Erklärung für diesen Widerspruch wäre, dass der transzelluläre Austausch über die BBB, welcher Makromoleküle passieren lässt unterbrochen sein kann, bevor der parazelluläre Transport für kleine Moleküle beeinträchtigt wird. Weiterhin legen meine Ergebnisse nahe, dass ET-1 SD nicht über eine BBB-Öffnung verursacht. Parallel dazu untersuchte ich, ob die Hyperkapnie-induzierten positiven DC-Shifts auch nach BBB-Öffnung auftreten. Der Hintergrund war hier die bestehende Behauptung, dass die Hyperkapnie-induzierten DC-Shifts an der intakten BBB generiert werden, im Gegensatz zu anderen DC-Potenzialänderungen bei epileptischer Aktivität oder SD, welche von Glia- und/oder Nervenzellen generiert werden. Die DHC- induzierte BBB-Öffnung verursachte jedoch keine Veränderung der positiven DC- Shifts. Dies passt sehr gut zu der Hypothese, dass DHC eher die transzellulären statt die parazellulären Passagewege beeinflusst. In einer zweiten Teilstudie, analysierte ich die mit ET-1-induzierter SD assoziierten pH-Wert- und Kaliumkonzentrationsänderungen. Die Resultate stellten ein weiteres Argument für die Entstehung dieser SDs durch die ET-1-induzierte Vasokonstriktion und Ischämie dar. In einer dritten Teilstudie zeigte Endothelin-1(1−31) (ET-1(1−31)), ein alternatives Zwischenprodukt des ET-1-Stoffwechsels, ähnliche Eigenschaften in der SD-Induktion wie ET-1, jedoch mit einer signifikant niedrigeren Potenz. Alle drei Teilstudien sind auf eine komplexe Art und Weise mit den bis heute noch nicht vollständig entschlüsselten und teilweise sogar widersprüchlichen Rollen, welche die BBB und SD in Erkrankungen des Gehirns spielen, verbunden. Vor allem aber liefern meine Ergebnisse wichtige Hinweise auf eine BBB-Öffnung für Makromoleküle, welche noch vor der Permeabilität für kleine Moleküle auftreten kann.
The blood-brain barrier (BBB) plays a critical role in the regulation of the brain microenvironment. The physiological mechanisms underlying the BBB and their changes during brain pathology are still largely unknown. In my thesis, I applied sodium-dehydrocholate (DHC) to the brain surface at a cranial window in rats, causing local BBB disruption. I was particularly interested in whether or not DHC-induced BBB disruption would lead to spreading depolarization (SD) because (i) endothelin-1(1−21) (ET-1), a potent inducer of SD, is known to open the BBB, and (ii) it recently was hypothesized that ET-1 induces SD via BBB disruption. SD is characterized as a wave of massive ion translocation between the intra- and extracellular space of neurons, near- complete sustained depolarization of neurons, neuronal swelling, an abrupt, large, negative change of the direct current (DC) potential and silencing of brain electrical activity (spreading depression). Now unequivocal electrophysiological evidence exists in the clinic that SDs occur in abundance in traumatic brain injury and stroke where they are assumed to facilitate neuronal damage. The same conditions are also associated with BBB disruption, and BBB disruption is also assumed to contribute to neuronal damage. Using intravenous administration of Evans Blue and a newly developed semi- quantitative Matlab® algorithm for evaluation, I was able to verify that DHC opened the BBB for the macromolecule albumin. Despite significant evidence of DHC-induced BBB disruption, I did not observe the occurrence of SDs using potassium-selective microelectrodes and laser-Doppler flowmetry. Moreover, I did not find that the small ion potassium increased in the extracellular space after DHC application although it is well known that there is a potassium gradient from the intravascular to the extracellular compartment. These results suggested that, under pathological conditions, the BBB can be permeable to macromolecules like albumin but, at the same time, it can be impassable for small molecules like potassium. A possible explanation for this paradox is that the transcellular pathway of the BBB, allowing the passage of macromolecules, can be disturbed before the paracellular pathway, that would allow small molecules to pass, is affected. Furthermore, my results suggested that ET-1 did not induce SD via BBB disruption. I also investigated in parallel the hypercapnia-induced positive DC-shift and whether this DC-shift would disappear after BBB disruption. The background to this study was the previously hypothesized generation of hypercapnia-induced DC-shifts at the BBB in contrast to other DC-shifts associated with ictal epileptic activity or SD, which are generated by glial cells or neurons. I found that DHC-induced BBB disruption did not change the hypercapnia-induced positive DC-shift which corresponds well with the hypothesis that DHC caused a disruption of the transcellular rather than the paracellular pathway of the BBB. In a second study, I analyzed the pH- and potassium-signals associated with ET-1-induced SDs. My findings provided a further argument that SDs in response to ET-1 are mediated by ET-1-induced vasoconstriction and ischemia. In a third study, I found that endothelin-1(1−31) (ET-1(1−31)), an alternate intermediate in the production of ET-1, induced SD in a similar fashion to ET-1 but with significantly less potency. All three studies are related in a complex manner to the yet enigmatic and sometimes counterintuitive roles that both BBB and SD play in brain pathology. Most importantly, my findings provide arguments that BBB disruption for macromolecules can occur before BBB disruption for small molecules.
