Das kanine kutane Histiozytom ist ein häufiger, gutartiger Hauttumor, der vor allem bei jungen Hunden auftritt. Histiozytome erscheinen als schnell wachsende, kuppelförmige Zubildungen, die häufig oberflächlich ulzerieren und vor allem an Kopf und Extremitäten auftreten. Ein wichtiges Charakteristikum dieser Neoplasie ist ihre Fähigkeit zur Spontanregression, die von einer massiven Entzündungszellinfiltration begleitet wird. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, Erkenntnisse über das Regressionsverhalten der Histiozytome in Hinblick auf weitere Tumordaten wie Lymphozytendifferenzierung, Größe, Ulzeration und Wachstumsaktivität zu gewinnen. Grundlage dieser Untersuchung sind 191 in Paraffin eingebettete Histiozytome von bis zu zwei Jahre alten Hunden aus dem Archivmaterial des Instituts für Veterinär-Pathologie der Freien Universität Berlin. Anhand ihres Erscheinungsbildes in den Paraffinblöcken werden die Histiozytome drei Größen zugeordnet (< 1 cm2; 1-2 cm2; > 2 cm2). Des weiteren wird der Grad der Ulzeration und nekrotischer Veränderungen für jeden Tumor an Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbten Schnitten semiquantitativ bestimmt. Bislang waren diese Parameter nicht Gegenstand intensiver Untersuchungen und ihr Auftreten wird hier erstmals anhand des umfangreichen Probenmaterials statistisch ausgewertet und auf Zusammenhänge zu den immunhistologischen Ergebnissen hin beurteilt. Die Subpopulationen der infiltrierenden Lymphozyten werden mit spezifischen Antikörpern gegen das CD3- und CD79alpha-Antigen immunhistologisch identifiziert. Da allgemein angenommen wird, dass die T-Lymphozyten in direktem Zusammenhang mit Entwicklung und Fortschreiten der Selbstheilung stehen, werden zunächst alle 191 Histiozytome aufgrund der quantitativ ermittelten Anzahl CD3+ T-Zellen vier Regressionsstufen zugeordnet. Zur Beurteilung der infiltrierenden CD79alpha+ B-Lymphozyten werden wiederum 60 Fälle (jeweils 30 Tumore ohne und 30 mit starker Ulzeration) ausgewählt und ihre Anzahl, Verteilung und mögliche Beziehungen zu Nekrosen, Ulzeration und T-Lymphozyten untersucht. Zusätzlich wird erstmals auch das Proliferationsverhalten der Histiozytome im Verlauf der Regression dokumentiert. Dazu werden mit Hilfe des MIB1-Antikörpers anhand von jeweils 15 Schnitten aus den Regressionsstufen I bis IV die proliferationsaktiven Zellen immunhistologisch markiert, um den Proliferationsindex zu bestimmen. Der immunhistologische Nachweis der CD79alpha- und MIB1-Antigene erfolgt unter Verwen-dung einer in dieser Arbeit modifizierten B-SA-Färbung. Erst durch diese Methode kann der CD79alpha- Antikörper am Paraffinschnitt zuverlässig und erfolgreich eingesetzt werden. In ge-zielten Vorversuchen zeigt sich eine verbesserte Anfärbung der Zielzellen sowie ein besserer Erhalt der Gewebestruktur als nach den etablierten B-SA- und ABC-Färbemethoden. Auch der MIB1-Antikörper lässt sich mit Hilfe dieser Methode besser darstellen. Bei der modifizierten B-SA-Methode werden die Schnitte zur Antigen Demaskierung zunächst 35 Minuten bei 95°C in einer Target-Retrieval-Lösung im Wasserbad behandelt. Die Vorbehandlung der Antigene im Wasserbad ermöglicht dabei eine gleichmäßige und schonende Erwärmung der Schnitte und wird daher der Mikrowellenbehandlung vorgezogen. Die verwendete Target-Lösung zeigt gegenüber der Vorbehandlung in Zitrat- oder EDTA-Lösung deutlich verbesser-te Ergebnisse. Anschließend werden die Schnitte mit den jeweiligen Primärantikörpern 40 Minuten bei Raumtemperatur und nachfolgend über Nacht bei 4°C inkubiert. Dabei wird der CD79α in einer Antikörper-Konzentration von 1:50 und der MIB1 in einer Konzentration von 1:80 verwendet. Die Untersuchungen zeigen, dass kleine Tumore (≤ 1 cm2) signifikant häufiger von Kopf und Hals und nur selten von den Extremitäten stammen. Darüber hinaus zeigen sie signifikant seltener ulzerative Veränderungen und Nekrosen als größere Tumore. Große Histiozytome (>2 cm2) weisen zudem signifikant häufiger eine starke (> 30 % des Epithels) Ulzeration auf, mit zunehmender Größe der Tumore steigt auch die Anzahl der Nekrosen leicht an. Darüber hinaus ergeben die immunhistologischen Untersuchungen einen signifikanten Anstieg der T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und der Proliferationsrate im Verlauf der Regression. Die den Tumor infiltrierenden Lymphozyten werden auch in dieser Untersuchung von den CD3+ T-Zellen dominiert. Dabei sinkt ihre Anzahl innerhalb der Tumore signifikant von der Peripherie zum Epithel hin ab. Insgesamt zeigt sich ein deutlicher Anstieg der Nekrosenzahl mit zunehmender Regression. Im Gegensatz zu früheren Darstellungen finden sich allerdings auch zahlreiche CD79+ B-Lymphozyten im Gewebe. Ihre Anzahl korreliert positiv mit der CD3+ T-Zellen, wobei sie jedoch signifikant häufiger im Tumorzentrum auftreten. Da auch bei kleinen Tumoren bereits Anzeichen einer fortgeschrittenen Regression auftreten, beginnt diese offensichtlich schon zu Beginn des Tumorwachstums. Beziehungen zwischen dem Auftreten sekundärer Entzündungserscheinungen und dem Fortschreiten der Regression lassen sich dagegen nicht feststellen. Trotz der Gutartigkeit der Histiozytome lässt sich eine überraschend hohe Teilungsrate gleichmäßig im gesamten Tumorgewebe beobachten: Der Proliferationsindex schwankt innerhalb der Regressionsstufen im Median zwischen 10 bis 23%. Dabei steigt die Proliferation der Tumorzellen zunächst mit zunehmender Regression signifikant an, um dann erst im Stadium weit fortgeschrittener Selbstheilung langsam abzusinken. Tumorgröße sowie Grad der Ulzeration und Anzahl der Nekrosen stehen dagegen in keiner auffälligen Beziehung zur Proliferation der Histiozytomzellen. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl das Tumorwachstum als auch der Tumorzelluntergang im Zusammenhang mit der Regression stehen. Dabei zeigt sich, dass die Selbstheilung schon zu Beginn der Tumor-Zell- Proliferation einsetzt und neben der zytolytischen Aktivität der T-Zellen möglicherweise mehr als angenommen auch von einer B-Zellvermittelten Immunität begleitet wird. Die hohe Proliferationsrate könnte sowohl durch eine Erhöhung der Antigenität der Tumore als auch durch die erhöhte Mitoserate selbst für die Induktion der Immunantwort verantwortlich sein. Möglicherweise trägt das aggressive Tumorwachstum somit indirekt zur eigenen Zerstörung bei.
The canine cutaneous histiocytoma is a commonly encountered benign skin tumor that frequently occurs in young dogs. Histiocytomas appear as rapidly growing, domeshaped tumors, mostly on the head and extremities, and often show superficial ulceration. One major characteristic of these tumors is the ability to undergo spontaneous regression, which is accompanied by massive infiltration of inflammatory cells. The aim of this study is to investigate the role of the different lymphocyte populations, tumor size, ulceration, necrosis, and proliferation in the regression of histiocytomas. This examination is based on 191 paraffinembedded and formalinfixed histiocytomas from dogs under two years of age taken from archive material of the Institute of Veterinary Pathology of the Freie Universität Berlin. The tumors are assigned to three different size classes (< 1 cm2; 1-2 cm2; >2 cm2) according to their appearance on the paraffin sections. In addition, degree of ulceration and necrosis are scored on an ordinal scale for each tumor from haematoxylin and eosin (HE) stained slices. To date, these parameters have not been the object of intensive research. In this study, the appearance of a large sample size of tumors is statistically evaluated and related to immunohistological results for the first time. The different subpopulations of the infiltrating lymphocytes are identified immunohistochemically by specific antibodies against CD3- and CD79α-antigens. It is assumed that T-lymphocytes are connected directly to the development and progression of selfealing. For that reason all of the 191 histiocytomas are divided into four stages of regression on the basis of their quantity of CD3+-T-cells. Additionally, the quantity, distribution and relation to necrosis, ulceration and T-lymphocytes of infiltrating CD79+-B-cells were compared in 60 cases: 30 tumors without and 30 with a high degree of ulceration. Furthermore the proliferation behaviour of histiocytomas through the course of regression is documented for the first time. Thereby the actively proliferating cells in 15 slices from each of the regression stages (I to IV) are marked with the antibody MIB1 in order to calculate a proliferation index. The CD79alpha- and MIB1-antigens are immunohistologically verified for this study by modified B-SA staining. Only through this method can the CD79α antibody be used reliably and successfully on paraffin-embedded sections. Preliminary tests show that this technique enables improved staining of target cells as well as better conservation of tissue structure than formerly established B-SA and ABC techniques. Also this modified method improves the illustration of the MIB1 antibody. In the modified B-SA staining procedure slices are initially incubated for 35 minutes in a water bath in Target Retrieval Solution at 95°C temperature for antigen demasking. Antigen pretreatment in the water bath enables a constant and gentle warming of the slices and is for that reason preferred to microwave heating treatment. The Target Solution shows improved results compared to pretreatment in citrat or EDTA solution. Afterwards, the slices are incubated with the respective primary antibodies for 40 minutes at room temperature and subsequently at 4°C overnight. The CD79α antibody is used at a dilution of 1:50 and the MIB1 antibody at a dilution of 1:80. The examinations show that small tumors (< 1 cm2 in diameter) originate with significantly higher frequency from the head and neck areas and seldom from the extremities. They also show statistically fewer necroses and less ulceration than larger tumors. Large histiocytomas (>2 cm2) have a significantly higher rate of strong ulceration (> 30 % of epithel). Also, number of necroses slightly increases with size of tumors. Immunohistological examinations demonstrate a significant increase of T- and B-lymphocytes and proliferation rate in the course of the regression. As expected, CD3+ T-cells dominate the tumor-infiltrating lymphocytes. Their number within the tumor decreases significantly from periphery to the epithel. Additionally, necrosis increases remarkably through the course of regression. In contrast to previous studies, there are also many CD79+ B-lymphocytes found in the tissue. These correlate with the number of CD3+ T cells, but occur more frequently in the center of the tumor. Since symptoms of an advanced regression are also found in small tumors, regression presumably occurs at the beginning of tumor growth. No correlation is found between occurrence of secondary inflammation and progression of the regression. Despite of the benign nature of the histiocytoma, proliferation rate all over the tumor is surprisingly high, varying within the regression stages between 10-23 % (medians). Tumor cell proliferation at first increases significantly with the regression, but slowly decreases at later regression stages. Tumor size, number of necroses and degree of ulceration are not correlated with proliferation rate. The results indicate a relation of both tumor growth and necrosis to the regression. Moreover, self healing already starts at the beginning of the tumor growth and is mediated not only by T-cell cytotoxicity but presumably also by B-cell activity. The high proliferation rate could be responsible for the initiation of immunity both by an increase of tumor antigen activity as well as by the increased mitotic rate itself. The aggressive tumor growth might therefore indirectly lead to its own destruction.
