dc.contributor.author
Spies, Nadja
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:35:56Z
dc.date.available
2006-03-10T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13587
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17785
dc.description
Deckblatt-Impressum
persönlicher Dank
Inhaltsverzeichnis
Einleitung
Literaturübersicht
Eigene Untersuchungen
Ergebnisse
Diskussion
Zusammenfassung
Summary
Literaturverzeichnis
Anhang
Danksagung
Selbständigkeitserklärung
dc.description.abstract
Das kanine kutane Histiozytom ist ein häufiger, gutartiger Hauttumor, der vor
allem bei jungen Hunden auftritt. Histiozytome erscheinen als schnell
wachsende, kuppelförmige Zubildungen, die häufig oberflächlich ulzerieren und
vor allem an Kopf und Extremitäten auftreten. Ein wichtiges Charakteristikum
dieser Neoplasie ist ihre Fähigkeit zur Spontanregression, die von einer
massiven Entzündungszellinfiltration begleitet wird. Ziel der vorliegenden
Arbeit ist es, Erkenntnisse über das Regressionsverhalten der Histiozytome in
Hinblick auf weitere Tumordaten wie Lymphozytendifferenzierung, Größe,
Ulzeration und Wachstumsaktivität zu gewinnen. Grundlage dieser Untersuchung
sind 191 in Paraffin eingebettete Histiozytome von bis zu zwei Jahre alten
Hunden aus dem Archivmaterial des Instituts für Veterinär-Pathologie der
Freien Universität Berlin. Anhand ihres Erscheinungsbildes in den
Paraffinblöcken werden die Histiozytome drei Größen zugeordnet (< 1 cm2; 1-2
cm2; > 2 cm2). Des weiteren wird der Grad der Ulzeration und nekrotischer
Veränderungen für jeden Tumor an Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbten Schnitten
semiquantitativ bestimmt. Bislang waren diese Parameter nicht Gegenstand
intensiver Untersuchungen und ihr Auftreten wird hier erstmals anhand des
umfangreichen Probenmaterials statistisch ausgewertet und auf Zusammenhänge zu
den immunhistologischen Ergebnissen hin beurteilt. Die Subpopulationen der
infiltrierenden Lymphozyten werden mit spezifischen Antikörpern gegen das CD3-
und CD79alpha-Antigen immunhistologisch identifiziert. Da allgemein angenommen
wird, dass die T-Lymphozyten in direktem Zusammenhang mit Entwicklung und
Fortschreiten der Selbstheilung stehen, werden zunächst alle 191 Histiozytome
aufgrund der quantitativ ermittelten Anzahl CD3+ T-Zellen vier
Regressionsstufen zugeordnet. Zur Beurteilung der infiltrierenden CD79alpha+
B-Lymphozyten werden wiederum 60 Fälle (jeweils 30 Tumore ohne und 30 mit
starker Ulzeration) ausgewählt und ihre Anzahl, Verteilung und mögliche
Beziehungen zu Nekrosen, Ulzeration und T-Lymphozyten untersucht. Zusätzlich
wird erstmals auch das Proliferationsverhalten der Histiozytome im Verlauf der
Regression dokumentiert. Dazu werden mit Hilfe des MIB1-Antikörpers anhand von
jeweils 15 Schnitten aus den Regressionsstufen I bis IV die
proliferationsaktiven Zellen immunhistologisch markiert, um den
Proliferationsindex zu bestimmen. Der immunhistologische Nachweis der
CD79alpha- und MIB1-Antigene erfolgt unter Verwen-dung einer in dieser Arbeit
modifizierten B-SA-Färbung. Erst durch diese Methode kann der CD79alpha-
Antikörper am Paraffinschnitt zuverlässig und erfolgreich eingesetzt werden.
In ge-zielten Vorversuchen zeigt sich eine verbesserte Anfärbung der
Zielzellen sowie ein besserer Erhalt der Gewebestruktur als nach den
etablierten B-SA- und ABC-Färbemethoden. Auch der MIB1-Antikörper lässt sich
mit Hilfe dieser Methode besser darstellen. Bei der modifizierten B-SA-Methode
werden die Schnitte zur Antigen Demaskierung zunächst 35 Minuten bei 95°C in
einer Target-Retrieval-Lösung im Wasserbad behandelt. Die Vorbehandlung der
Antigene im Wasserbad ermöglicht dabei eine gleichmäßige und schonende
Erwärmung der Schnitte und wird daher der Mikrowellenbehandlung vorgezogen.
Die verwendete Target-Lösung zeigt gegenüber der Vorbehandlung in Zitrat- oder
EDTA-Lösung deutlich verbesser-te Ergebnisse. Anschließend werden die Schnitte
mit den jeweiligen Primärantikörpern 40 Minuten bei Raumtemperatur und
nachfolgend über Nacht bei 4°C inkubiert. Dabei wird der CD79α in einer
Antikörper-Konzentration von 1:50 und der MIB1 in einer Konzentration von 1:80
verwendet. Die Untersuchungen zeigen, dass kleine Tumore (≤ 1 cm2) signifikant
häufiger von Kopf und Hals und nur selten von den Extremitäten stammen.
Darüber hinaus zeigen sie signifikant seltener ulzerative Veränderungen und
Nekrosen als größere Tumore. Große Histiozytome (>2 cm2) weisen zudem
signifikant häufiger eine starke (> 30 % des Epithels) Ulzeration auf, mit
zunehmender Größe der Tumore steigt auch die Anzahl der Nekrosen leicht an.
Darüber hinaus ergeben die immunhistologischen Untersuchungen einen
signifikanten Anstieg der T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und der
Proliferationsrate im Verlauf der Regression. Die den Tumor infiltrierenden
Lymphozyten werden auch in dieser Untersuchung von den CD3+ T-Zellen
dominiert. Dabei sinkt ihre Anzahl innerhalb der Tumore signifikant von der
Peripherie zum Epithel hin ab. Insgesamt zeigt sich ein deutlicher Anstieg der
Nekrosenzahl mit zunehmender Regression. Im Gegensatz zu früheren
Darstellungen finden sich allerdings auch zahlreiche CD79+ B-Lymphozyten im
Gewebe. Ihre Anzahl korreliert positiv mit der CD3+ T-Zellen, wobei sie jedoch
signifikant häufiger im Tumorzentrum auftreten. Da auch bei kleinen Tumoren
bereits Anzeichen einer fortgeschrittenen Regression auftreten, beginnt diese
offensichtlich schon zu Beginn des Tumorwachstums. Beziehungen zwischen dem
Auftreten sekundärer Entzündungserscheinungen und dem Fortschreiten der
Regression lassen sich dagegen nicht feststellen. Trotz der Gutartigkeit der
Histiozytome lässt sich eine überraschend hohe Teilungsrate gleichmäßig im
gesamten Tumorgewebe beobachten: Der Proliferationsindex schwankt innerhalb
der Regressionsstufen im Median zwischen 10 bis 23%. Dabei steigt die
Proliferation der Tumorzellen zunächst mit zunehmender Regression signifikant
an, um dann erst im Stadium weit fortgeschrittener Selbstheilung langsam
abzusinken. Tumorgröße sowie Grad der Ulzeration und Anzahl der Nekrosen
stehen dagegen in keiner auffälligen Beziehung zur Proliferation der
Histiozytomzellen. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl das Tumorwachstum als
auch der Tumorzelluntergang im Zusammenhang mit der Regression stehen. Dabei
zeigt sich, dass die Selbstheilung schon zu Beginn der Tumor-Zell-
Proliferation einsetzt und neben der zytolytischen Aktivität der T-Zellen
möglicherweise mehr als angenommen auch von einer B-Zellvermittelten Immunität
begleitet wird. Die hohe Proliferationsrate könnte sowohl durch eine Erhöhung
der Antigenität der Tumore als auch durch die erhöhte Mitoserate selbst für
die Induktion der Immunantwort verantwortlich sein. Möglicherweise trägt das
aggressive Tumorwachstum somit indirekt zur eigenen Zerstörung bei.
de
dc.description.abstract
The canine cutaneous histiocytoma is a commonly encountered benign skin tumor
that frequently occurs in young dogs. Histiocytomas appear as rapidly growing,
domeshaped tumors, mostly on the head and extremities, and often show
superficial ulceration. One major characteristic of these tumors is the
ability to undergo spontaneous regression, which is accompanied by massive
infiltration of inflammatory cells. The aim of this study is to investigate
the role of the different lymphocyte populations, tumor size, ulceration,
necrosis, and proliferation in the regression of histiocytomas. This
examination is based on 191 paraffinembedded and formalinfixed histiocytomas
from dogs under two years of age taken from archive material of the Institute
of Veterinary Pathology of the Freie Universität Berlin. The tumors are
assigned to three different size classes (< 1 cm2; 1-2 cm2; >2 cm2) according
to their appearance on the paraffin sections. In addition, degree of
ulceration and necrosis are scored on an ordinal scale for each tumor from
haematoxylin and eosin (HE) stained slices. To date, these parameters have not
been the object of intensive research. In this study, the appearance of a
large sample size of tumors is statistically evaluated and related to
immunohistological results for the first time. The different subpopulations of
the infiltrating lymphocytes are identified immunohistochemically by specific
antibodies against CD3- and CD79α-antigens. It is assumed that T-lymphocytes
are connected directly to the development and progression of selfealing. For
that reason all of the 191 histiocytomas are divided into four stages of
regression on the basis of their quantity of CD3+-T-cells. Additionally, the
quantity, distribution and relation to necrosis, ulceration and T-lymphocytes
of infiltrating CD79+-B-cells were compared in 60 cases: 30 tumors without and
30 with a high degree of ulceration. Furthermore the proliferation behaviour
of histiocytomas through the course of regression is documented for the first
time. Thereby the actively proliferating cells in 15 slices from each of the
regression stages (I to IV) are marked with the antibody MIB1 in order to
calculate a proliferation index. The CD79alpha- and MIB1-antigens are
immunohistologically verified for this study by modified B-SA staining. Only
through this method can the CD79α antibody be used reliably and successfully
on paraffin-embedded sections. Preliminary tests show that this technique
enables improved staining of target cells as well as better conservation of
tissue structure than formerly established B-SA and ABC techniques. Also this
modified method improves the illustration of the MIB1 antibody. In the
modified B-SA staining procedure slices are initially incubated for 35 minutes
in a water bath in Target Retrieval Solution at 95°C temperature for antigen
demasking. Antigen pretreatment in the water bath enables a constant and
gentle warming of the slices and is for that reason preferred to microwave
heating treatment. The Target Solution shows improved results compared to
pretreatment in citrat or EDTA solution. Afterwards, the slices are incubated
with the respective primary antibodies for 40 minutes at room temperature and
subsequently at 4°C overnight. The CD79α antibody is used at a dilution of
1:50 and the MIB1 antibody at a dilution of 1:80. The examinations show that
small tumors (< 1 cm2 in diameter) originate with significantly higher
frequency from the head and neck areas and seldom from the extremities. They
also show statistically fewer necroses and less ulceration than larger tumors.
Large histiocytomas (>2 cm2) have a significantly higher rate of strong
ulceration (> 30 % of epithel). Also, number of necroses slightly increases
with size of tumors. Immunohistological examinations demonstrate a significant
increase of T- and B-lymphocytes and proliferation rate in the course of the
regression. As expected, CD3+ T-cells dominate the tumor-infiltrating
lymphocytes. Their number within the tumor decreases significantly from
periphery to the epithel. Additionally, necrosis increases remarkably through
the course of regression. In contrast to previous studies, there are also many
CD79+ B-lymphocytes found in the tissue. These correlate with the number of
CD3+ T cells, but occur more frequently in the center of the tumor. Since
symptoms of an advanced regression are also found in small tumors, regression
presumably occurs at the beginning of tumor growth. No correlation is found
between occurrence of secondary inflammation and progression of the
regression. Despite of the benign nature of the histiocytoma, proliferation
rate all over the tumor is surprisingly high, varying within the regression
stages between 10-23 % (medians). Tumor cell proliferation at first increases
significantly with the regression, but slowly decreases at later regression
stages. Tumor size, number of necroses and degree of ulceration are not
correlated with proliferation rate. The results indicate a relation of both
tumor growth and necrosis to the regression. Moreover, self healing already
starts at the beginning of the tumor growth and is mediated not only by T-cell
cytotoxicity but presumably also by B-cell activity. The high proliferation
rate could be responsible for the initiation of immunity both by an increase
of tumor antigen activity as well as by the increased mitotic rate itself. The
aggressive tumor growth might therefore indirectly lead to its own
destruction.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
immunohistochemistry
dc.subject
tissue proliferation
dc.subject
neoplasm-regression
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
Immunhistochemische Untersuchungen des kaninen kutanen Histiozytoms zur
näheren Charakterisierung des Regressions- und Proliferationsverhal-tens
dieses Tumors
dc.contributor.firstReferee
Univ.-Prof. Dr. Roland Rudolph
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. Barbara Kohn
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. Karl Dietrich Weyrauch
dc.date.accepted
2005-03-04
dc.date.embargoEnd
2006-03-13
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2006001602
dc.title.translated
Immunohistochemical study of canine cutaneous histiocytoma with
characterization of the regression and proliferation behavior in these tumors
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000002526
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2006/160/
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FUDISS_derivate_000000002526
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