The kinetics and intermediates of the photocycle and photoreversal of photoactive yellow protein were investigated from pH 4.6 to 11 by time- resolved absorption spectroscopy. At pH 7, three intermediate states: I1 (Abs. max. ~ 460 nm), I2 (Abs. max. ~ 370 nm) and I2' (Abs. max. ~ 350 nm) were observed. I2' is the signaling state of this photoreceptor. The time courses and the spectra of these intermediates were constructed using the extrapolated difference method. From the rise of I2' (~ 1.0 ms) to the end of the cycle, I1, I2 and I2' are in equilibrium. The equilibrium between I2 and I2' is pH dependent. Upon increasing the pH from 4.6 to 8.4, the I2 population decreases whereas I2' increases with a pKa of ~6.4. This pKa might be assigned to the carboxylate side chain of E46. Due to the pH dependent I2/I2' equilibrium, the ground state recovery rate is also pH dependent with the same pKa. At pH 10, three intermediate states: I1, I1' and I2' were observed. The spectrum of I1' (lmax ~ 425nm) was determined. From the rise of I2' (~ 1.0 ms) to the end of the cycle, I1, I1' and I2' are in a pH dependent equilibrium with a pKa of ~ 9.9. Upon increasing the pH from 8 to 11, the I1/I1' population increases whereas I2' decreases. This pKa is assigned to the deprotonation of the phenol of the exposed chromophore. I2 contributes minimally in this pH range. The rate constant for the ground state recovery also has a pKa of ~ 10 suggesting that k3 ~ [I2']. Thus, the pH controls the accumulation of the signaling state I2'. The kinetics of photoreversal from the I1, I2 and I2' intermediates was investigated with double flash excitation. A first flash, at 430 nm, initiated the photocycle. After a variable time delay, the I1 intermediate was photoreversed by a second flash, at 500 nm, or a mixture of I2 and I2' intermediates was photoreversed by a second flash, at 355 nm. The photoreversal times from the I1, I2 and I2' intermediates are respectively <1 µs (unresolved), 57 µs and 380 µs at pH 6. The first step in photoreversal is unresolved cis-trans isomerization of the chromophore. The respective delay dependent photoreversal amplitudes corresponding to 57 µs and 380 µs confirmed the temporal variation of the I2 and I2' intermediates of the normal cycle, and I2 and I2' are in equilibrium after 5 ms. Measurement of the pH dependent photoreversal amplitudes with 355 nm as a second flash applied with a delay of 20 ms, and at pH range from 4.6 to 8.5 produced a pKa ~6.1. This confirms the normal cycle I2/ I2' equilibrium. Depending on the progression of the photocycle, reversal becomes slower with the time delay, thus mirroring the individual steps of the forward photocycle. Photoreversal experiments at pH 10 with the second flash at 355 nm confirm the presence of the I1' and I2' intermediates and absence of the I2.
Die Kinetik und Intermediate der Rückreaktion des Photozyklus des Photoactive Yellow Protein im pH-Bereich von 4.6 bis 11 wurden mittels zeitaufgelöster Absorptions-Spektroskopie untersucht. Bei pH 7 wurden drei Intermediate : I1 (Abs. max. ~ 460 nm), I2 (Abs. max. ~ 370 nm) and I2' (Abs. max. ~ 350 nm) beobachtet. I2' ist der Signalzustand des Photorezeptors. Die Zeitspuren und Spektren dieser Intermediate wurden mit der extrapolierten Differenzmethode berechnet. Von der Bildung von I2' (~ 1.0 ms) bis zum Ende des Zyklus sind I1, I2 und I2' im thermischen Gleichgewicht. Das Gleichgewicht zwischen I2 und I2' ist pH-abhängig. Bei Erhöhung des pH von 4,6 auf 8,4 nimmt der I2-Anteil bei gleichzeitiger Zunahme des I2'-Anteils mit einem pKa von ~6.4 ab. Dieser pKa kann der Carboxylat-Seitenkette des E46 zugeordnet werden. Aufgrund des pH- abhängigen I2/I2'-Gleichgewichts ist auch die Rate der Rückkehr in den Grundzustand pH abhängig bei gleichem pKa. Bei pH 10 wurden drei Intermediate: I1, I1' und I2' beobachtet. Das Spektrum von I1' (Abs. max. ~ 425nm) wurde bestimmt. Von der Bildung von I2' (~ 1.0 ms) bis zum Ende des Zyklus sind I1, I1' und I2' im pH-abhängigen Gleichgewicht mit einem pKa von ~ 9.9. Bei Erhöhung des pH von 8 auf 11 steigt der I1/I1'-Anteil am Gleichgewicht bei gleichzeitiger Abnahme des I2'-Anteils an. Dieser pKa kann der Deprotonierung des Phenols des exponierten Chromophors zugeordnet werden. Der I2 -Beitrag zum Gleichgewicht ist in diesem pH-Bereich zu vernachlässigen. Die Rate der Rückkehr in den Grundzustand hat ebenfalls einen pKa von ca. 10 was k3 ~ [I2'] nahelegt. Somit kontrolliert der pH die Akkumulation des Signalzustands I2'. Die Kinetik der Photorückreaktion der Intermediate I1, I2 und I2' wurde mit einem Doppelblitzexperiment untersucht. Ein erster Blitz bei 430nm initiert den Photozyklus. Nach einer variablen (einstellbaren) Zeitverzögerung wurde das Intermediat I1 durch einen zweiten Blitz bei 500 nm oder eine Mischung der Intermediate I2 und I2' durch einen zweiten Blitz bei 355 nm zurückgeschossen. Die Zeitkonstante der Photorückreaktion der Intermediate I1, I2 und I2' bei pH 6 ist jeweils <1 µs (nicht aufgelöst), 57 µs und 380 µs. Der erste Schritt der Photorückreaktion ist die zeitlich nicht aufglöste cis-trans Isomerisierung des Chromophors. Die von der Zeitverzögerung abhängigen Amplituden der Photorückreaktion von 57 µs und 380 µs untermauern die zeitabhängige Änderung der I2- und I2'-Anteile im normalen Zyklus zudem stehen I2 und I2' ab 5 ms im Gleichgewicht. Die Messung der pH-abhängigen Amplituden der Photorückreaktion mit einem zweiten Blitz bei 355 nm nach einer Zeitverzögerung von 20 ms im pH Bereich von 4.6 bis 8.5 resultierten in einem pKa ~6.1. Dies bestätigt ein I2/ I2' Gleichgewicht im normalen Zyklus. Im Verlauf des Photozyklus wird die Photorückreaktion in Abhängigkeit von der Zeitverzögerung langsamer, was die einzelnen Übergänge im normalen Photozyklus widerspiegelt. Die Photorückreaktionsexperimente bei pH 10 mit dem zweiten Blitz bei 355 nm bestätigen das Vorhandensein der Intermediate I1' and I2' und das Fehlen von I2 im Zyklus.
