dc.contributor.author
Joshi, Chandra P.
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:29:36Z
dc.date.available
2008-07-03T08:59:56.659Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13427
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17625
dc.description.abstract
The kinetics and intermediates of the photocycle and photoreversal of
photoactive yellow protein were investigated from pH 4.6 to 11 by time-
resolved absorption spectroscopy. At pH 7, three intermediate states: I1 (Abs.
max. ~ 460 nm), I2 (Abs. max. ~ 370 nm) and I2' (Abs. max. ~ 350 nm) were
observed. I2' is the signaling state of this photoreceptor. The time courses
and the spectra of these intermediates were constructed using the extrapolated
difference method. From the rise of I2' (~ 1.0 ms) to the end of the cycle,
I1, I2 and I2' are in equilibrium. The equilibrium between I2 and I2' is pH
dependent. Upon increasing the pH from 4.6 to 8.4, the I2 population decreases
whereas I2' increases with a pKa of ~6.4. This pKa might be assigned to the
carboxylate side chain of E46. Due to the pH dependent I2/I2' equilibrium, the
ground state recovery rate is also pH dependent with the same pKa. At pH 10,
three intermediate states: I1, I1' and I2' were observed. The spectrum of I1'
(lmax ~ 425nm) was determined. From the rise of I2' (~ 1.0 ms) to the end of
the cycle, I1, I1' and I2' are in a pH dependent equilibrium with a pKa of ~
9.9. Upon increasing the pH from 8 to 11, the I1/I1' population increases
whereas I2' decreases. This pKa is assigned to the deprotonation of the phenol
of the exposed chromophore. I2 contributes minimally in this pH range. The
rate constant for the ground state recovery also has a pKa of ~ 10 suggesting
that k3 ~ [I2']. Thus, the pH controls the accumulation of the signaling state
I2'. The kinetics of photoreversal from the I1, I2 and I2' intermediates was
investigated with double flash excitation. A first flash, at 430 nm, initiated
the photocycle. After a variable time delay, the I1 intermediate was
photoreversed by a second flash, at 500 nm, or a mixture of I2 and I2'
intermediates was photoreversed by a second flash, at 355 nm. The
photoreversal times from the I1, I2 and I2' intermediates are respectively <1
µs (unresolved), 57 µs and 380 µs at pH 6. The first step in photoreversal is
unresolved cis-trans isomerization of the chromophore. The respective delay
dependent photoreversal amplitudes corresponding to 57 µs and 380 µs confirmed
the temporal variation of the I2 and I2' intermediates of the normal cycle,
and I2 and I2' are in equilibrium after 5 ms. Measurement of the pH dependent
photoreversal amplitudes with 355 nm as a second flash applied with a delay of
20 ms, and at pH range from 4.6 to 8.5 produced a pKa ~6.1. This confirms the
normal cycle I2/ I2' equilibrium. Depending on the progression of the
photocycle, reversal becomes slower with the time delay, thus mirroring the
individual steps of the forward photocycle. Photoreversal experiments at pH 10
with the second flash at 355 nm confirm the presence of the I1' and I2'
intermediates and absence of the I2.
de
dc.description.abstract
Die Kinetik und Intermediate der Rückreaktion des Photozyklus des Photoactive
Yellow Protein im pH-Bereich von 4.6 bis 11 wurden mittels zeitaufgelöster
Absorptions-Spektroskopie untersucht. Bei pH 7 wurden drei Intermediate : I1
(Abs. max. ~ 460 nm), I2 (Abs. max. ~ 370 nm) and I2' (Abs. max. ~ 350 nm)
beobachtet. I2' ist der Signalzustand des Photorezeptors. Die Zeitspuren und
Spektren dieser Intermediate wurden mit der extrapolierten Differenzmethode
berechnet. Von der Bildung von I2' (~ 1.0 ms) bis zum Ende des Zyklus sind I1,
I2 und I2' im thermischen Gleichgewicht. Das Gleichgewicht zwischen I2 und I2'
ist pH-abhängig. Bei Erhöhung des pH von 4,6 auf 8,4 nimmt der I2-Anteil bei
gleichzeitiger Zunahme des I2'-Anteils mit einem pKa von ~6.4 ab. Dieser pKa
kann der Carboxylat-Seitenkette des E46 zugeordnet werden. Aufgrund des pH-
abhängigen I2/I2'-Gleichgewichts ist auch die Rate der Rückkehr in den
Grundzustand pH abhängig bei gleichem pKa. Bei pH 10 wurden drei Intermediate:
I1, I1' und I2' beobachtet. Das Spektrum von I1' (Abs. max. ~ 425nm) wurde
bestimmt. Von der Bildung von I2' (~ 1.0 ms) bis zum Ende des Zyklus sind I1,
I1' und I2' im pH-abhängigen Gleichgewicht mit einem pKa von ~ 9.9. Bei
Erhöhung des pH von 8 auf 11 steigt der I1/I1'-Anteil am Gleichgewicht bei
gleichzeitiger Abnahme des I2'-Anteils an. Dieser pKa kann der Deprotonierung
des Phenols des exponierten Chromophors zugeordnet werden. Der I2 -Beitrag zum
Gleichgewicht ist in diesem pH-Bereich zu vernachlässigen. Die Rate der
Rückkehr in den Grundzustand hat ebenfalls einen pKa von ca. 10 was k3 ~ [I2']
nahelegt. Somit kontrolliert der pH die Akkumulation des Signalzustands I2'.
Die Kinetik der Photorückreaktion der Intermediate I1, I2 und I2' wurde mit
einem Doppelblitzexperiment untersucht. Ein erster Blitz bei 430nm initiert
den Photozyklus. Nach einer variablen (einstellbaren) Zeitverzögerung wurde
das Intermediat I1 durch einen zweiten Blitz bei 500 nm oder eine Mischung der
Intermediate I2 und I2' durch einen zweiten Blitz bei 355 nm zurückgeschossen.
Die Zeitkonstante der Photorückreaktion der Intermediate I1, I2 und I2' bei pH
6 ist jeweils <1 µs (nicht aufgelöst), 57 µs und 380 µs. Der erste Schritt der
Photorückreaktion ist die zeitlich nicht aufglöste cis-trans Isomerisierung
des Chromophors. Die von der Zeitverzögerung abhängigen Amplituden der
Photorückreaktion von 57 µs und 380 µs untermauern die zeitabhängige Änderung
der I2- und I2'-Anteile im normalen Zyklus zudem stehen I2 und I2' ab 5 ms im
Gleichgewicht. Die Messung der pH-abhängigen Amplituden der Photorückreaktion
mit einem zweiten Blitz bei 355 nm nach einer Zeitverzögerung von 20 ms im pH
Bereich von 4.6 bis 8.5 resultierten in einem pKa ~6.1. Dies bestätigt ein I2/
I2' Gleichgewicht im normalen Zyklus. Im Verlauf des Photozyklus wird die
Photorückreaktion in Abhängigkeit von der Zeitverzögerung langsamer, was die
einzelnen Übergänge im normalen Photozyklus widerspiegelt. Die
Photorückreaktionsexperimente bei pH 10 mit dem zweiten Blitz bei 355 nm
bestätigen das Vorhandensein der Intermediate I1' and I2' und das Fehlen von
I2 im Zyklus.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Photoactive Yellow Protein
dc.subject
Transient Absorption Spectroscopy
dc.subject
Kinetics Mechanism
dc.subject
Double Flash Experiment
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::530 Physik
dc.title
Kinetics and mechanism of the photocycle of photoactive yellow protein
dc.contributor.contact
chandra.joshi@physik.fu-berlin.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Maarten P. Heyn
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Robert Bittl
dc.date.accepted
2006-07-05
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000004107-3
dc.title.translated
Kinetik und Mechanismus des Photozyklus des Photoactive Yellow Protein
de
refubium.affiliation
Physik
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000004107
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000003930
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access