Calcineurin, eine Ca2+/Calmodulin abhängige Proteinphosphatase, ist an verschiedenen Signalübertragungskaskaden beteiligt, die die Entwicklung und Funktion von Immun-, Nerven-, Kardiovaskular- und Muskelskelettsystemen steuern. Auch in sozialen Amöben der Spezies Dictyostelium discoideum konnte ein Homolog des aus zwei Untereinheiten bestehenden Calcineurin A und B Holoenzyms isoliert und biochemisch charakterisiert werden. In dieser Arbeit wurde die Rolle der regulatorischen Untereinheit Calcineurin B (CNB) in D. discoideum untersucht. Im ersten Teil wird die Herstellung von RNAi-Zelllinien mit reduzierter CNB Konzentration und deren weitere Charakterisierung zur Aufklärung der Funktion von Calcineurin beschrieben. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Identifizierung einer entwicklungsregulierten Endonuklease, die für die unkonventionelle Prozessierung der Calcineurin B mRNA verantwortlich ist. Zur Manipulation der Konzentration an intrazellulärem CNB wurde sowohl ein Knockout-Konstrukt als auch ein RNAi-Konstrukt zum Silencing durch RNA Interferenz hergestellt. Über das Einfügen einer Resistenzkassette konnte kein Knockout Klon selektioniert werden, was auf eine essentielle Rolle von CNB beim vegetativen Wachstum der haploiden Amöben hindeutet. Dagegen führte das Einbringen eines RNAi-Konstrukts gegen die mRNA für CNB (cnbA) zu mehreren unabhängigen Klonen mit unterschiedlicher Reduktion der CNB Konzentration. Bei Zelllinien mit reduzierter CNB Konzentration wurden die Phagozytose, das vegetatives Wachstum und die Differenzierung analysiert. Waren bei vegetativem Wachstum und Phagozytose keine signifikanten Unterschiede zum Wildtyp zu beobachten, zeigten Differenzierungstests, dass bei Zelllinien mit deutlich reduzierter CNB Konzentration die Entwicklung der Amöben verlangsamt war und die Fruchtkörper kürzere Stiele mit zusätzlichen Spitzen am Sporenkopf aufwiesen. Versuche mit GFP-markierten Chimären aus Wildtyp- und Mutantenzellen zeigten keine unregelmäßige Verteilung der Zellen im slug. Die Expression des stielspezifischen Entwicklungsmarkers ecmB war in RNAi Mutanten reduziert. Die Ergebnisse stellen ein Spiegelbild der phänotypischen Defekte von D. discoideum Glykogensynthasekinase 3 (GskA) und β-Catenin Nullmutanten dar. Es wird daher ein Modell vorgeschlagen, bei dem in Prästielzellen ein durch das Morphogen DIF (differentiation-inducing factor) induzierter Anstieg an freiem intrazellulärem Calcium Calcineurin aktiviert und Calcineurin dieses Signal durch Dephosphorylierung eines cytosolischen Transkriptionsfaktors weiterleitet. Der dephosphorylierte Faktor ist in der Lage, in den Kern einzuwandern und die Expression prästielspezifischer Gene zu induzieren. In Vorarbeiten wurde bereits gezeigt, dass Calcineurin B durch einen neuen unkonventionellen Mechanismus auf mRNA Ebene prozessiert wird. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine entwicklungsregulierte Endonuklease für die Prozessierung verantwortlich ist. In dieser Arbeit wurde eine Screening-Methode für die Identifizierung der nukleolytischen Aktivität mit Hilfe eines genetischen Ansatzes etabliert.
Calcineurin, a Ca2+/calmodulin dependent protein phosphatase, is important for various signal transduction cascades which regulate development and function of immune, nervous, cardiovascular and muscle systems. In the amoeba Dictyostelium discoideum the two calcineurin subunits A and B could be isolated and biochemically characterised. In this work the role of the regulatory subunit calcineurin B (CNB) in D. discoideum was studied. The first part describes the generation of RNAi cell lines with reduced CNB concentration and their characterisation to elucidate the function of calcineurin. The second part deals with the identification of a developmentally regulated endonuclease which is responsible for the unconventionally processing of the calcineurin B mRNA. For the manipulation of the intracellular CNB concentration a knockout construct as well as a RNAi construct was cloned. It was not possible to isolate knockout clones by homologous recombination of a selection marker suggesting an essential role for CNB in vegetative growth of the haploid amoebas. In contrast, the transformation of cells with a RNAi construct against mRNA of cnbA led to a variety of silencing levels of CNB in different recombinant cell lines. Cell lines with reduced CNB concentration were analysed for phagocytosis, vegetative growth and differentiation. There were no significant differences in vegetative growth and phagocytosis compared to the wildtype. In cell lines with dramatically reduced CNB concentration differentiation tests revealed decelerated development and fruiting bodies with shorter stalks and additional ectopic tips at the spore head. Experiments using GFP-labelled chimaeras from wildtype and mutant cells showed no irregular distribution of the cells in the slug. The Expression of the stalk-specific gene ecmB was repressed in RNAi mutants. The results mirror the phenotypic defects in null mutants of the Dictyostelium glycogen synthase kinase 3 (GskA) and β-catenin (Aar) pathways. Therefore it is proposed that calcineurin mediates the effects of a differentiation-inducing factor (DIF)-elicited increase in free intracellular calcium in prestalk cells via the dephosphorylation of a cytosolic transcription complex component which activates the expression of prestalk genes. Previous work showed that the coding mRNA for calcineurin B is processed by a new unconventional mechanism. The results suggest an endonuclease to be responsible for the processing. In this work a screening method for the identification of the nucleolytic activity was established using a genetic approach.
