dc.contributor.author
Böckeler, Katrina
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:25:00Z
dc.date.available
2005-07-07T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13346
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17544
dc.description
Titelseite und Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Zusammenfassung
1\. Einleitung
2\. Material und Methoden
3\. Ergebnisse
4\. Diskussion
5\. Literaturverzeichnis
6\. Veröffentlichungen
7\. Danksagung
8\. Lebenslauf
dc.description.abstract
Calcineurin, eine Ca2+/Calmodulin abhängige Proteinphosphatase, ist an
verschiedenen Signalübertragungskaskaden beteiligt, die die Entwicklung und
Funktion von Immun-, Nerven-, Kardiovaskular- und Muskelskelettsystemen
steuern. Auch in sozialen Amöben der Spezies Dictyostelium discoideum konnte
ein Homolog des aus zwei Untereinheiten bestehenden Calcineurin A und B
Holoenzyms isoliert und biochemisch charakterisiert werden. In dieser Arbeit
wurde die Rolle der regulatorischen Untereinheit Calcineurin B (CNB) in D.
discoideum untersucht. Im ersten Teil wird die Herstellung von RNAi-Zelllinien
mit reduzierter CNB Konzentration und deren weitere Charakterisierung zur
Aufklärung der Funktion von Calcineurin beschrieben. Der zweite Teil der
Arbeit beschäftigt sich mit der Identifizierung einer entwicklungsregulierten
Endonuklease, die für die unkonventionelle Prozessierung der Calcineurin B
mRNA verantwortlich ist. Zur Manipulation der Konzentration an intrazellulärem
CNB wurde sowohl ein Knockout-Konstrukt als auch ein RNAi-Konstrukt zum
Silencing durch RNA Interferenz hergestellt. Über das Einfügen einer
Resistenzkassette konnte kein Knockout Klon selektioniert werden, was auf eine
essentielle Rolle von CNB beim vegetativen Wachstum der haploiden Amöben
hindeutet. Dagegen führte das Einbringen eines RNAi-Konstrukts gegen die mRNA
für CNB (cnbA) zu mehreren unabhängigen Klonen mit unterschiedlicher Reduktion
der CNB Konzentration. Bei Zelllinien mit reduzierter CNB Konzentration wurden
die Phagozytose, das vegetatives Wachstum und die Differenzierung analysiert.
Waren bei vegetativem Wachstum und Phagozytose keine signifikanten
Unterschiede zum Wildtyp zu beobachten, zeigten Differenzierungstests, dass
bei Zelllinien mit deutlich reduzierter CNB Konzentration die Entwicklung der
Amöben verlangsamt war und die Fruchtkörper kürzere Stiele mit zusätzlichen
Spitzen am Sporenkopf aufwiesen. Versuche mit GFP-markierten Chimären aus
Wildtyp- und Mutantenzellen zeigten keine unregelmäßige Verteilung der Zellen
im slug. Die Expression des stielspezifischen Entwicklungsmarkers ecmB war in
RNAi Mutanten reduziert. Die Ergebnisse stellen ein Spiegelbild der
phänotypischen Defekte von D. discoideum Glykogensynthasekinase 3 (GskA) und
β-Catenin Nullmutanten dar. Es wird daher ein Modell vorgeschlagen, bei dem in
Prästielzellen ein durch das Morphogen DIF (differentiation-inducing factor)
induzierter Anstieg an freiem intrazellulärem Calcium Calcineurin aktiviert
und Calcineurin dieses Signal durch Dephosphorylierung eines cytosolischen
Transkriptionsfaktors weiterleitet. Der dephosphorylierte Faktor ist in der
Lage, in den Kern einzuwandern und die Expression prästielspezifischer Gene zu
induzieren. In Vorarbeiten wurde bereits gezeigt, dass Calcineurin B durch
einen neuen unkonventionellen Mechanismus auf mRNA Ebene prozessiert wird. Die
Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine entwicklungsregulierte Endonuklease
für die Prozessierung verantwortlich ist. In dieser Arbeit wurde eine
Screening-Methode für die Identifizierung der nukleolytischen Aktivität mit
Hilfe eines genetischen Ansatzes etabliert.
de
dc.description.abstract
Calcineurin, a Ca2+/calmodulin dependent protein phosphatase, is important for
various signal transduction cascades which regulate development and function
of immune, nervous, cardiovascular and muscle systems. In the amoeba
Dictyostelium discoideum the two calcineurin subunits A and B could be
isolated and biochemically characterised. In this work the role of the
regulatory subunit calcineurin B (CNB) in D. discoideum was studied. The first
part describes the generation of RNAi cell lines with reduced CNB
concentration and their characterisation to elucidate the function of
calcineurin. The second part deals with the identification of a
developmentally regulated endonuclease which is responsible for the
unconventionally processing of the calcineurin B mRNA. For the manipulation of
the intracellular CNB concentration a knockout construct as well as a RNAi
construct was cloned. It was not possible to isolate knockout clones by
homologous recombination of a selection marker suggesting an essential role
for CNB in vegetative growth of the haploid amoebas. In contrast, the
transformation of cells with a RNAi construct against mRNA of cnbA led to a
variety of silencing levels of CNB in different recombinant cell lines. Cell
lines with reduced CNB concentration were analysed for phagocytosis,
vegetative growth and differentiation. There were no significant differences
in vegetative growth and phagocytosis compared to the wildtype. In cell lines
with dramatically reduced CNB concentration differentiation tests revealed
decelerated development and fruiting bodies with shorter stalks and additional
ectopic tips at the spore head. Experiments using GFP-labelled chimaeras from
wildtype and mutant cells showed no irregular distribution of the cells in the
slug. The Expression of the stalk-specific gene ecmB was repressed in RNAi
mutants. The results mirror the phenotypic defects in null mutants of the
Dictyostelium glycogen synthase kinase 3 (GskA) and β-catenin (Aar) pathways.
Therefore it is proposed that calcineurin mediates the effects of a
differentiation-inducing factor (DIF)-elicited increase in free intracellular
calcium in prestalk cells via the dephosphorylation of a cytosolic
transcription complex component which activates the expression of prestalk
genes. Previous work showed that the coding mRNA for calcineurin B is
processed by a new unconventional mechanism. The results suggest an
endonuclease to be responsible for the processing. In this work a screening
method for the identification of the nucleolytic activity was established
using a genetic approach.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
differentiation
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Analyse der Genexpression von Calcineurin B in Dictyostelium discoideum
dc.contributor.firstReferee
Prof. Rupert Mutzel
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Tina Romeis
dc.date.accepted
2005-07-04
dc.date.embargoEnd
2005-09-06
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2005001677
dc.title.translated
Analysis of the expression of Calcineurin B in Dictyostelium discoideum
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000001785
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2005/167/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000001785
dcterms.accessRights.dnb
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dcterms.accessRights.openaire
open access