dc.contributor.author
Graaf, Daniel de
dc.date.accessioned
2018-06-07T15:37:08Z
dc.date.available
2010-01-19T10:45:00.223Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/1331
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-5533
dc.description
Table of contents VI 1.1 Abstract 1 1.2 Zusammenfassung 2 2 Introduction 4 2.1
Bacteria – host cell interactions 4 2.1.1 Bacterial adherence to and invasion
of target cells 4 2.2 Neisseria spp. 6 2.2.1 Meningococcal pathogenesis 6
2.2.2 Gonococcal pathogenesis and clinical manifestations 7 2.2.3 N.
gonorrhoeae adhesion to and invasion of epithelial cells 8 2.2.3.1 Type IV
pili 8 2.2.3.2 Opa proteins 11 2.2.3.3 Lipooligosaccharides (LOS) 13 2.2.3.4
Porin 14 2.2.3.5 Models for N. gonorrhoeae invasion 15 2.3 Caveolae and lipid
rafts 17 2.3.1 Biochemical properties 17 2.3.2 Structure of caveolae and
caveolins 18 2.3.3 Function of caveolae 20 2.3.3.1 Caveolae involvement in
cellular signaling events 20 2.3.3.2 Caveolae and endocytosis 21 2.3.4 Role of
lipid rafts and caveolae in bacterial infections 23 3 Objectives 25 4 Results
26 4.1 Microarray analysis of infected AGS vs infected caveolin-1 expressing
AGS cells 26 4.2 Confirmation of microarray results by quantitative real-time
PCR (qRT-PCR) 28 4.3 Impact of stimulation and inhibition of PKA activity on
N. gonorrhoeae internalization 31 4.4 N. gonorrhoeae activates the PKA pathway
of epithelial cells 35 4.5 Recruitment of VASP to infecting N. gonorrhoeae 36
4.6 VASP knockdown affects N. gonorrhoeae internalization 38 4.7 AC/PKA
pathway influences N. gonorrhoeae association with caveolin and lysosomal
compartments 42 4.8 ErbB2 and Src in N. gonorrhoeae infection 46 4.9 N.
gonorrhoeae triggered actin and VASP dynamics 48 5 Discussion 53 5.1 AC/PKA
pathway in pilus mediated N. gonorrhoeae invasion 53 5.2 VASP and N.
gonorrhoeae infection 56 5.3 Actin recruitment, dynamics and actin-caveolin
interplay 57 5.4 Signalling through caveolae/lipid rafts relevant to N.
gonorrhoeae internalization 59 6 Conclusion 63 7 Materials 64 7.1 Bacteria 64
7.1.1 E. coli 64 7.1.2 N. gonorrhoeae 64 7.2 Cell culture 64 7.3 Cell culture
media and supplements 65 7.4 Media for bacterial culture 65 7.5 Plasmid
vectors 66 7.6 Oligonucleotides 66 7.7 Antibodies 67 7.8 Buffers and solutions
68 7.9 Chemical reagents 70 7.10 Kits 71 7.11 Appliances and consumable
materials 71 7.12 Software 72 8 Methods 73 8.1 Cell culture methods 73 8.1.1
Passaging of cells 73 8.1.2 Transfection of cells 74 8.1.2.1 Transfection of
plasmid DNA 74 8.1.3 Infection of cells with N. gonorrhoeae 74 8.1.4
Gentamicin protection assay 75 8.2 Growth and manipulation of bacteria 75
8.2.1 Growth of N. gonorrhoeae 75 8.2.2 Growth of E. coli 76 8.2.3 Preparation
of DNA competent E. coli 76 8.2.4 Transformation of E. coli 76 8.3 Nucleic
acid methods 77 8.3.1 Preparative isolation of plasmid DNA 77 8.3.2 RNA
purification from adherent cells 78 8.3.3 Quantitative real-time polymerase
chain reaction (qRT-PCR) 78 8.3.4 RNA interference (RNAi) 79 8.4 Protein
biochemical methods 80 8.4.1 Discontinuous SDS polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS PAGE) 80 8.4.2 Coomassie® stain of protein gels 81 8.4.3
Immuno blot (Western blot) 81 8.4.4 Membrane stripping 82 8.4.5 Protein co-
immuno precipitation 82 8.4.6 Purification of PilC 83 8.5 Microscopy 84 8.5.1
Confocal laser scanning microscopy 84 8.5.1.1 Indirect immunofluorescence
staining 84 8.5.1.2 Differential indirect immunofluorescence staining of
bacteria 84 8.5.1.3 Confocal laser scanning microscopy 85 8.5.2 Life cell
imaging microscopy 85 9 References 86 10 Index 101 10.1 Figure Index 101 10.2
Abbreviations 103 10.3 Curriculum vitae 106 10.4 Acknowledgements 107
dc.description.abstract
The type VI pili (Tfp) of the Gram-negative bacterium Neisseria gonorrhoeae
(Ngo) are crucial virulence factors for the colonization of its sole natural
host, Homo sapiens. They do not only mediate the first step in infection by
adhering to the host cell surface, but also contribute to other adhesion and
invasion processes in concert with other virulence factors like the colony
opacity associated (Opa) proteins and lipooligosaccharides (LOS). Furthermore,
they are able to promote invasion into some cell lines. Recently, it was shown
that piliated gonococci elicit clustering of the membrane-associated protein
caveolin-1 beneath attachment sites, and that downregulation of caveolin by
RNA interference (RNAi) increased gonococcal invasion. Complementarily,
expression of caveolin-1 in caveolin-deficient epithelial cells blocked
internalization. Here, it is demonstrated in a microarray experiment comparing
gene regulation of infected epithelial cells with and without caveolin, that
the regulatory subunit of the protein kinase A (PKA-RI) was highly
upregulated in both cell lines. Pharmacological inhibition of PKA resulted in
a strong increase of invasion in AGS and ME180 epithelial cells, whereas PKA
agonists had the opposite effect. Adenylyl cyclase (AC) and PKA activity were
increased during the first two hours of Ngo infection, starting around 10
minutes after the addition of bacteria and coinciding with pilus-mediated
attachment. The PKA substrate vasodilator stimulated phosphoprotein (VASP) was
phosphorylated in response to Ngo infection and enriched at the sites of
attaching bacteria. Moreover, alteration of PKA activity had strong impact on
caveolin-1 recruitment to gonococcal microcolonies. These findings suggest a
role for PKA and VASP in the invasion process of N. gonorrhoeae by
contributing to the assembly of an actin-caveolin network that blocks
internalization during localized adherence. Using life cell imaging
microscopy, actin and VASP distribution and dynamics could be monitored,
providing insights into the formation of actin clusters beneath gonococcal
microcolonies. In addition, actin- and VASP rocketing was also observed in
epithelial cells, and infection influenced actin-based comet tails. Whether
internalized gonococci, like other microorganisms, have the capacity to induce
or hijack actin comet tails to move intracellularly could not ultimately be
proven.
de
dc.description.abstract
Die Typ IV Pili (Tfp) des Gram-negativen Bacteriums Neisseria gonorrhoeae sind
wichtige Virulenzfaktoren für die Besiedelung ihres einzigen natürlichen
Wirtes Homo sapiens. Diese vermitteln den ersten Infektionsschritt durch
Adherenz an die Wirtszelloberfläche und tragen, gemeinsam mit anderen Faktoren
wie Opa Proteinen und Lipooligosacchariden (LOS), zusätzlich zu anderen
Adherenzvorgängen und zu Invasionsprozessen bei. Darüber hinaus verstärken
Pili die bakterielle Invasion in bestimmte Zelllinien. Vor kurzem konnte
gezeigt werden, dass pilierte Gonokokken das membranassozierte Protein
Caveolin unterhalb der Bindungsstelle auf Epithelzellen akkumulieren und das
Ausschalten der Caveolinexpression mittels RNA-Interferenz (RNAi) die
Gonokokkeninvasion erhöht. Komplementär hierzu wurde die Invasion durch
Caveolinexpression in Zellen, welche normalerweise kein Caveolin
synthetisieren, blockiert. In dieser Arbeit konnte bei dem Vergleich von
infizierten Zellen mit und ohne Caveolin mit Hilfe eines Microarray-
Experimentes eine starke Überexpression der regulatorischen Untereinheit der
Proteinkinase A (PKA-RI) in beiden Zelllinien festgestellt werden.
Pharmakologische Untersuchungen zeigten einen starken Anstieg der Invasion
durch PKA-Inhibierung, eine Behandlung der Zellen mit PKA-Agonisten hingegen
resultierte in verminderter Invasion. Die enzymatische Aktivität der
Adenylylzyklase (AC) und der PKA war während der ersten beiden Stunden einer
Gonokokkeninfektion erhöht. Dieser Effekt trat bereits zehn Minuten nach
Bakterienzugabe auf und damit zeitgleich mit dem Beginn der Pilus-vermittelten
Adherenz. Das PKA-Substrat „vasodilator stimulated phosphoprotein“ (VASP)
wurde durch Neisserieninfektion phosphoryliert und zu den Adherenzstellen der
Bakterien rekrutiert. Des Weiteren wurde die Rekrutierung von Caveolin-1 zu
bakteriellen Mikrokolonien durch die Beeinflussung der PKA-Aktivität stark
verändert. Dies zeigt, dass PKA und VASP in Invasionsprozessen von N.
gonorrhoeae beteiligt sind, indem diese zum Aufbau eines Caveolin-Actin-
Geflechts beitragen, welche die Aufnahme der Bakterien in die Zelle hemmt.
Mittels „life cell imaging“ Mikroskopie konnte die Verteilung und Dynamik von
Aktin- und VASP-GFP Molekülen beobachtet werden, welche Einblicke in die
Entstehung von Aktin-Clustern unterhalb von bakteriellen Mikrokolonien
ergaben. Darüber hinaus wurden dynamische Strukturen, welche als Aktin- bzw.
VASP-Kometen bezeichnet werden, in den verwendeten Epithelzellen entdeckt.
Diese auf Aktinpolymerisation basierenden Strukturen wurden durch
Neisserieninfektion beeinflusst. Ob intrazelluläre Gonokokken diese als
Fortbewegungsmittel nutzen oder selbst induzieren, konnte nicht zweifelsfrei
geklärt werden.
de
dc.format.extent
VIII, 107 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
epithelial cell
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Adherence to and invasion of epithelial cells by Neisseria gonorrhoeae
dc.contributor.contact
degraaf@gmx.net
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Thomas F. Meyer
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Petra Knaus
dc.date.accepted
2009-11-23
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000014970-6
dc.title.translated
Adhärenz an und Invasion von Epithelzellen durch Neisseria gonorrhoeae
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000014970
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000006843
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access