The type VI pili (Tfp) of the Gram-negative bacterium Neisseria gonorrhoeae (Ngo) are crucial virulence factors for the colonization of its sole natural host, Homo sapiens. They do not only mediate the first step in infection by adhering to the host cell surface, but also contribute to other adhesion and invasion processes in concert with other virulence factors like the colony opacity associated (Opa) proteins and lipooligosaccharides (LOS). Furthermore, they are able to promote invasion into some cell lines. Recently, it was shown that piliated gonococci elicit clustering of the membrane-associated protein caveolin-1 beneath attachment sites, and that downregulation of caveolin by RNA interference (RNAi) increased gonococcal invasion. Complementarily, expression of caveolin-1 in caveolin-deficient epithelial cells blocked internalization. Here, it is demonstrated in a microarray experiment comparing gene regulation of infected epithelial cells with and without caveolin, that the regulatory subunit of the protein kinase A (PKA-RI) was highly upregulated in both cell lines. Pharmacological inhibition of PKA resulted in a strong increase of invasion in AGS and ME180 epithelial cells, whereas PKA agonists had the opposite effect. Adenylyl cyclase (AC) and PKA activity were increased during the first two hours of Ngo infection, starting around 10 minutes after the addition of bacteria and coinciding with pilus-mediated attachment. The PKA substrate vasodilator stimulated phosphoprotein (VASP) was phosphorylated in response to Ngo infection and enriched at the sites of attaching bacteria. Moreover, alteration of PKA activity had strong impact on caveolin-1 recruitment to gonococcal microcolonies. These findings suggest a role for PKA and VASP in the invasion process of N. gonorrhoeae by contributing to the assembly of an actin-caveolin network that blocks internalization during localized adherence. Using life cell imaging microscopy, actin and VASP distribution and dynamics could be monitored, providing insights into the formation of actin clusters beneath gonococcal microcolonies. In addition, actin- and VASP rocketing was also observed in epithelial cells, and infection influenced actin-based comet tails. Whether internalized gonococci, like other microorganisms, have the capacity to induce or hijack actin comet tails to move intracellularly could not ultimately be proven.
Die Typ IV Pili (Tfp) des Gram-negativen Bacteriums Neisseria gonorrhoeae sind wichtige Virulenzfaktoren für die Besiedelung ihres einzigen natürlichen Wirtes Homo sapiens. Diese vermitteln den ersten Infektionsschritt durch Adherenz an die Wirtszelloberfläche und tragen, gemeinsam mit anderen Faktoren wie Opa Proteinen und Lipooligosacchariden (LOS), zusätzlich zu anderen Adherenzvorgängen und zu Invasionsprozessen bei. Darüber hinaus verstärken Pili die bakterielle Invasion in bestimmte Zelllinien. Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass pilierte Gonokokken das membranassozierte Protein Caveolin unterhalb der Bindungsstelle auf Epithelzellen akkumulieren und das Ausschalten der Caveolinexpression mittels RNA-Interferenz (RNAi) die Gonokokkeninvasion erhöht. Komplementär hierzu wurde die Invasion durch Caveolinexpression in Zellen, welche normalerweise kein Caveolin synthetisieren, blockiert. In dieser Arbeit konnte bei dem Vergleich von infizierten Zellen mit und ohne Caveolin mit Hilfe eines Microarray- Experimentes eine starke Überexpression der regulatorischen Untereinheit der Proteinkinase A (PKA-RI) in beiden Zelllinien festgestellt werden. Pharmakologische Untersuchungen zeigten einen starken Anstieg der Invasion durch PKA-Inhibierung, eine Behandlung der Zellen mit PKA-Agonisten hingegen resultierte in verminderter Invasion. Die enzymatische Aktivität der Adenylylzyklase (AC) und der PKA war während der ersten beiden Stunden einer Gonokokkeninfektion erhöht. Dieser Effekt trat bereits zehn Minuten nach Bakterienzugabe auf und damit zeitgleich mit dem Beginn der Pilus-vermittelten Adherenz. Das PKA-Substrat „vasodilator stimulated phosphoprotein“ (VASP) wurde durch Neisserieninfektion phosphoryliert und zu den Adherenzstellen der Bakterien rekrutiert. Des Weiteren wurde die Rekrutierung von Caveolin-1 zu bakteriellen Mikrokolonien durch die Beeinflussung der PKA-Aktivität stark verändert. Dies zeigt, dass PKA und VASP in Invasionsprozessen von N. gonorrhoeae beteiligt sind, indem diese zum Aufbau eines Caveolin-Actin- Geflechts beitragen, welche die Aufnahme der Bakterien in die Zelle hemmt. Mittels „life cell imaging“ Mikroskopie konnte die Verteilung und Dynamik von Aktin- und VASP-GFP Molekülen beobachtet werden, welche Einblicke in die Entstehung von Aktin-Clustern unterhalb von bakteriellen Mikrokolonien ergaben. Darüber hinaus wurden dynamische Strukturen, welche als Aktin- bzw. VASP-Kometen bezeichnet werden, in den verwendeten Epithelzellen entdeckt. Diese auf Aktinpolymerisation basierenden Strukturen wurden durch Neisserieninfektion beeinflusst. Ob intrazelluläre Gonokokken diese als Fortbewegungsmittel nutzen oder selbst induzieren, konnte nicht zweifelsfrei geklärt werden.
