id,collection,dc.contributor.author,dc.contributor.contact,dc.contributor.firstReferee,dc.contributor.furtherReferee,dc.contributor.gender,dc.date.accepted,dc.date.accessioned,dc.date.available,dc.date.issued,dc.description,dc.description.abstract[de],dc.format.extent,dc.identifier.uri,dc.identifier.urn,dc.language,dc.rights.uri,dc.subject,dc.subject.ddc,dc.title,dc.title.translated[de],dc.type,dcterms.accessRights.dnb,dcterms.accessRights.openaire,dcterms.format[de],refubium.affiliation[de],refubium.mycore.derivateId,refubium.mycore.fudocsId "9e05f34d-f6d8-4c9f-a86f-ac65da175461","fub188/14","Graaf, Daniel de","degraaf@gmx.net","Prof. Dr. Thomas F. Meyer","Prof. Dr. Petra Knaus","n","2009-11-23","2018-06-07T15:37:08Z","2010-01-19T10:45:00.223Z","2009","Table of contents VI 1.1 Abstract 1 1.2 Zusammenfassung 2 2 Introduction 4 2.1 Bacteria – host cell interactions 4 2.1.1 Bacterial adherence to and invasion of target cells 4 2.2 Neisseria spp. 6 2.2.1 Meningococcal pathogenesis 6 2.2.2 Gonococcal pathogenesis and clinical manifestations 7 2.2.3 N. gonorrhoeae adhesion to and invasion of epithelial cells 8 2.2.3.1 Type IV pili 8 2.2.3.2 Opa proteins 11 2.2.3.3 Lipooligosaccharides (LOS) 13 2.2.3.4 Porin 14 2.2.3.5 Models for N. gonorrhoeae invasion 15 2.3 Caveolae and lipid rafts 17 2.3.1 Biochemical properties 17 2.3.2 Structure of caveolae and caveolins 18 2.3.3 Function of caveolae 20 2.3.3.1 Caveolae involvement in cellular signaling events 20 2.3.3.2 Caveolae and endocytosis 21 2.3.4 Role of lipid rafts and caveolae in bacterial infections 23 3 Objectives 25 4 Results 26 4.1 Microarray analysis of infected AGS vs infected caveolin-1 expressing AGS cells 26 4.2 Confirmation of microarray results by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) 28 4.3 Impact of stimulation and inhibition of PKA activity on N. gonorrhoeae internalization 31 4.4 N. gonorrhoeae activates the PKA pathway of epithelial cells 35 4.5 Recruitment of VASP to infecting N. gonorrhoeae 36 4.6 VASP knockdown affects N. gonorrhoeae internalization 38 4.7 AC/PKA pathway influences N. gonorrhoeae association with caveolin and lysosomal compartments 42 4.8 ErbB2 and Src in N. gonorrhoeae infection 46 4.9 N. gonorrhoeae triggered actin and VASP dynamics 48 5 Discussion 53 5.1 AC/PKA pathway in pilus mediated N. gonorrhoeae invasion 53 5.2 VASP and N. gonorrhoeae infection 56 5.3 Actin recruitment, dynamics and actin-caveolin interplay 57 5.4 Signalling through caveolae/lipid rafts relevant to N. gonorrhoeae internalization 59 6 Conclusion 63 7 Materials 64 7.1 Bacteria 64 7.1.1 E. coli 64 7.1.2 N. gonorrhoeae 64 7.2 Cell culture 64 7.3 Cell culture media and supplements 65 7.4 Media for bacterial culture 65 7.5 Plasmid vectors 66 7.6 Oligonucleotides 66 7.7 Antibodies 67 7.8 Buffers and solutions 68 7.9 Chemical reagents 70 7.10 Kits 71 7.11 Appliances and consumable materials 71 7.12 Software 72 8 Methods 73 8.1 Cell culture methods 73 8.1.1 Passaging of cells 73 8.1.2 Transfection of cells 74 8.1.2.1 Transfection of plasmid DNA 74 8.1.3 Infection of cells with N. gonorrhoeae 74 8.1.4 Gentamicin protection assay 75 8.2 Growth and manipulation of bacteria 75 8.2.1 Growth of N. gonorrhoeae 75 8.2.2 Growth of E. coli 76 8.2.3 Preparation of DNA competent E. coli 76 8.2.4 Transformation of E. coli 76 8.3 Nucleic acid methods 77 8.3.1 Preparative isolation of plasmid DNA 77 8.3.2 RNA purification from adherent cells 78 8.3.3 Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) 78 8.3.4 RNA interference (RNAi) 79 8.4 Protein biochemical methods 80 8.4.1 Discontinuous SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE) 80 8.4.2 Coomassie® stain of protein gels 81 8.4.3 Immuno blot (Western blot) 81 8.4.4 Membrane stripping 82 8.4.5 Protein co- immuno precipitation 82 8.4.6 Purification of PilC 83 8.5 Microscopy 84 8.5.1 Confocal laser scanning microscopy 84 8.5.1.1 Indirect immunofluorescence staining 84 8.5.1.2 Differential indirect immunofluorescence staining of bacteria 84 8.5.1.3 Confocal laser scanning microscopy 85 8.5.2 Life cell imaging microscopy 85 9 References 86 10 Index 101 10.1 Figure Index 101 10.2 Abbreviations 103 10.3 Curriculum vitae 106 10.4 Acknowledgements 107","The type VI pili (Tfp) of the Gram-negative bacterium Neisseria gonorrhoeae (Ngo) are crucial virulence factors for the colonization of its sole natural host, Homo sapiens. They do not only mediate the first step in infection by adhering to the host cell surface, but also contribute to other adhesion and invasion processes in concert with other virulence factors like the colony opacity associated (Opa) proteins and lipooligosaccharides (LOS). Furthermore, they are able to promote invasion into some cell lines. Recently, it was shown that piliated gonococci elicit clustering of the membrane-associated protein caveolin-1 beneath attachment sites, and that downregulation of caveolin by RNA interference (RNAi) increased gonococcal invasion. Complementarily, expression of caveolin-1 in caveolin-deficient epithelial cells blocked internalization. Here, it is demonstrated in a microarray experiment comparing gene regulation of infected epithelial cells with and without caveolin, that the regulatory subunit of the protein kinase A (PKA-RI) was highly upregulated in both cell lines. Pharmacological inhibition of PKA resulted in a strong increase of invasion in AGS and ME180 epithelial cells, whereas PKA agonists had the opposite effect. Adenylyl cyclase (AC) and PKA activity were increased during the first two hours of Ngo infection, starting around 10 minutes after the addition of bacteria and coinciding with pilus-mediated attachment. The PKA substrate vasodilator stimulated phosphoprotein (VASP) was phosphorylated in response to Ngo infection and enriched at the sites of attaching bacteria. Moreover, alteration of PKA activity had strong impact on caveolin-1 recruitment to gonococcal microcolonies. These findings suggest a role for PKA and VASP in the invasion process of N. gonorrhoeae by contributing to the assembly of an actin-caveolin network that blocks internalization during localized adherence. Using life cell imaging microscopy, actin and VASP distribution and dynamics could be monitored, providing insights into the formation of actin clusters beneath gonococcal microcolonies. In addition, actin- and VASP rocketing was also observed in epithelial cells, and infection influenced actin-based comet tails. Whether internalized gonococci, like other microorganisms, have the capacity to induce or hijack actin comet tails to move intracellularly could not ultimately be proven.||Die Typ IV Pili (Tfp) des Gram-negativen Bacteriums Neisseria gonorrhoeae sind wichtige Virulenzfaktoren für die Besiedelung ihres einzigen natürlichen Wirtes Homo sapiens. Diese vermitteln den ersten Infektionsschritt durch Adherenz an die Wirtszelloberfläche und tragen, gemeinsam mit anderen Faktoren wie Opa Proteinen und Lipooligosacchariden (LOS), zusätzlich zu anderen Adherenzvorgängen und zu Invasionsprozessen bei. Darüber hinaus verstärken Pili die bakterielle Invasion in bestimmte Zelllinien. Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass pilierte Gonokokken das membranassozierte Protein Caveolin unterhalb der Bindungsstelle auf Epithelzellen akkumulieren und das Ausschalten der Caveolinexpression mittels RNA-Interferenz (RNAi) die Gonokokkeninvasion erhöht. Komplementär hierzu wurde die Invasion durch Caveolinexpression in Zellen, welche normalerweise kein Caveolin synthetisieren, blockiert. In dieser Arbeit konnte bei dem Vergleich von infizierten Zellen mit und ohne Caveolin mit Hilfe eines Microarray- Experimentes eine starke Überexpression der regulatorischen Untereinheit der Proteinkinase A (PKA-RI) in beiden Zelllinien festgestellt werden. Pharmakologische Untersuchungen zeigten einen starken Anstieg der Invasion durch PKA-Inhibierung, eine Behandlung der Zellen mit PKA-Agonisten hingegen resultierte in verminderter Invasion. Die enzymatische Aktivität der Adenylylzyklase (AC) und der PKA war während der ersten beiden Stunden einer Gonokokkeninfektion erhöht. Dieser Effekt trat bereits zehn Minuten nach Bakterienzugabe auf und damit zeitgleich mit dem Beginn der Pilus-vermittelten Adherenz. Das PKA-Substrat „vasodilator stimulated phosphoprotein“ (VASP) wurde durch Neisserieninfektion phosphoryliert und zu den Adherenzstellen der Bakterien rekrutiert. Des Weiteren wurde die Rekrutierung von Caveolin-1 zu bakteriellen Mikrokolonien durch die Beeinflussung der PKA-Aktivität stark verändert. Dies zeigt, dass PKA und VASP in Invasionsprozessen von N. gonorrhoeae beteiligt sind, indem diese zum Aufbau eines Caveolin-Actin- Geflechts beitragen, welche die Aufnahme der Bakterien in die Zelle hemmt. Mittels „life cell imaging“ Mikroskopie konnte die Verteilung und Dynamik von Aktin- und VASP-GFP Molekülen beobachtet werden, welche Einblicke in die Entstehung von Aktin-Clustern unterhalb von bakteriellen Mikrokolonien ergaben. Darüber hinaus wurden dynamische Strukturen, welche als Aktin- bzw. VASP-Kometen bezeichnet werden, in den verwendeten Epithelzellen entdeckt. Diese auf Aktinpolymerisation basierenden Strukturen wurden durch Neisserieninfektion beeinflusst. Ob intrazelluläre Gonokokken diese als Fortbewegungsmittel nutzen oder selbst induzieren, konnte nicht zweifelsfrei geklärt werden.","VIII, 107 S.","https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/1331||http://dx.doi.org/10.17169/refubium-5533","urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000014970-6","eng","http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen","Neisseria||epithelial cell||pilus||adherence||invasion||PKA||VASP","500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie","Adherence to and invasion of epithelial cells by Neisseria gonorrhoeae","Adhärenz an und Invasion von Epithelzellen durch Neisseria gonorrhoeae","Dissertation","free","open access","Text","Biologie, Chemie, Pharmazie","FUDISS_derivate_000000006843","FUDISS_thesis_000000014970"