Gaucher's disease belongs to the rare lysosomal storage disorders and occurs with a frequency of 1 in 40,000–60,000 in the general population. The disease is caused by a defect in the activity of the lysosomal enzyme β-glucocerebrosidase. Three distinct clinical types have been identified: Type I (non-neuronopathic), involving only the peripheral nervous system occur the most frequently. Patients show a variety of symptoms, but enlargement of the spleen or liver and anaemia are often manifested. Gaucher’s disease type II (acute neuronopathic) and type III (chronic or subacute neuronopathic) involve the peripheral as well as the central nervous system. In type II, disease onset occurs already between 3–6 months after birth and patients die within the first 2–3 years of life. This type of disease is the most devastating one. Type III occurs later in life than type II, and patients survive to their third or fourth decade of life. Over 250 mutations have been described in the gene encoding β-glucocerebrosidase. Therefore, as in most lysosomal storage diseases, a direct genotype–phenotype correlation is impossible. So far, therapeutic approaches for treating Gaucher’s disease have not been fully satisfactory. The therapy in most frequent current use, and the most promising, is enzyme replacement therapy for type I. In types II and III this treatment fails to bring about any improvements, owing to the inability of the replacement enzymes to cross the blood–brain barrier. In the past, different approaches have been taken to find a way to overcome the blood–brain barrier in order to present therapeutic enzymes such as β-glucocerebrosidase to cells in the brain. Until today, such approaches have not been sufficient. Therefore, the aim of this study was the establishment and optimisation of the adeno-associated viral gene transfer of β-glucocerebrosidase into cortical organotypic brain-slice cultures representing Gaucher’s disease type II. The K14 lnl mouse strain, characterised in the present study, showed the typical signs of disease. The homozygous knockout mice showed distinctly reduced GCase activity in the brain compared with their healthy littermates, representing Gaucher’s disease type II. Further neuronal loss and astrogliosis was detected in K14 knockout mice. Moreover, a vector coding for the therapeutic gene β-glucocerebrosidase under the control of the CMV promoter was cloned. Successful GCase activity of this vector and of a vector under the control of the CAG promoter was determined after transfecting fibroblasts from a Gaucher patient and in primary neurons derived from K14 embryos. Thereafter, AAV2 viral particles were packed with vectors coding either the β-glucocerebrosidase fused to the ApoB binding domain or the LacZ gene. Characterised K14 knockout mice were used to establish an ex vivo model of cortical organotypic brain-slice cultures representing Gaucher’s disease type II. These characterised cortical organotypic brain-slice cultures of K14 knockout mice were transduced with the differently packed AAV2 particles to investigate the transfer of the β-glucocerebrosidase gene. Significant increases of GCase activity were measured in slices transduced with AAV2 particles containing the therapeutic enzyme, compared with either mock transduced slices or non-transduced slices. The overall results obtained in the present study lead to the conclusion that the packed AAV2 particles produced appear to be sufficient for further tests of their applicability in therapeutic approaches.
Morbus Gaucher gehört zu den seltenen lysosomalen Speicherkrankheiten und tritt bei 1 von 40.000–60.000 der allgemeinen Bevölkerung auf. Die Krankheit wird durch einen Defekt in der Aktivität des lysosmalen Enzyms β-Glukozerebrosidase hervorgerufen. Drei unterschiedliche klinische Typen sind bekannt und beschrieben worden. Bei Typ I (nicht-neuronopathisch), der am Häufigsten auftritt, ist ausschließlich das periphere Nervensystem involviert. Die Patienten zeigen eine Vielfalt an Symptomen, jedoch äußern sich eine Organvergrößerung der Milz und Leber, sowie Anämie häufig. Bei den Morbus Gaucher Typen II (akut neuronopathisch) und III (chronisch oder subakut neuronopathisch) ist sowohl das periphere, als auch das zentrale Nervensystem involviert. In Typ II, dem verheerendsten der drei Typen, manifestiert sich die Krankheit bereits in den ersten 3-6 Monaten nach der Geburt und die Patienten sterben innerhalb ihrer ersten 2-3 Lebensjahre. Typ III tritt später als Typ II auf und die Patienten überleben bis in ihre 30er / 40er Jahre. Über 250 Mutationen wurden im Gen der β-Glukozerebrosidase beschrieben, daher ist eine direkte Genotyp-Phänotyp Korrelation, wie in den meisten lysosmalen Speicherkrankheiten, nicht möglich. Bis dato, waren die therapeutischen Versuche Morbus Gaucher zu heilen nicht erfolgsversprechend. Die Therapie die mittlerweile am häufigsten zum Einsatz kommt, ist die Enzymersatztherapie für Typ I. Bei Typ II und III führt diese Therapie zu keinen Verbesserungen, da das rekombinante Enzym die Blut-Hirn-Schranke nicht passieren kann. In den letzten Jahren wurden einige Versuche unternommen um Enzyme, wie die β-Glukozerebrosidase über die Blut-Hirn-Schranke zu bringen und den Zellen im Gehirn zu präsentieren. Bis heute waren diese Versuche ohne Erfolg. Daher war das Ziel der vorliegenden These, die Etablierung und Optimierung eines Adeno- assoziierten viralen Gentransfers der β-Glukozerebrosidase in organotypische Hirnschnittkulturen, die den Typ II des Morbus Gaucher wiederspiegeln. Die K14 -lnl-Mäuse, die in dieser Studie charakterisiert wurden, zeigten die typischen Symptome der Krankheit des akut neuronopathischen Typen. Die homozygoten (knockout) Mäuse wiesen eine signifikant reduzierte Aktivität der Glukozerebrosidase im Gehirn, verglichen mit der Aktivität im Gehirn ihrer gesunden Geschwistertiere auf. Des Weiteren konnte der Verlust von Nervenzellen und eine Astrogliose im Gehirn der K14-Knoukout-Mäuse histologisch nachgewiesen werden. Außerdem wurde ein Vektor kloniert, der die β-Glukozerebrosidase unter der Kontrolle des CMV-Promoters exprimieren soll. Die GCase-Aktivität und -Expression wurde erfolgreich durch die Transfektion primärer Neuronenkulturen von K14-ko-Mäusen und Fibroblasten von M.G. Patienten mit dem klonierten Vektor unter CMV Kontrolle und einem Vektor unter Kontrolle des CAG-Promoters nachgewiesen. Danach wurden AAV2 virale Partikel verpackt, entweder mit einem der Vektoren, die die β-Glukozerebrosidase epxrimieren oder LacZ. Für die Etablierung kortikaler organotypischer Hirnschnitte, die ein ex-vivo-Modell des Morbus Gaucher Typ II repräsentieren, wurden die zuvor charakterisierten K14 ko Mäuse verwendet. Die charakterisierten Hirnschnitte wurden mit unterschiedlich verpackten AAV2 Partikeln transduziert, um den Gentransfer der β-Glukozerebrosidase zu untersuchen. Die GCase-Aktivität war in Schnitten die mit den GCase verpackten AAV2 Partikeln transduziert wurden, verglichen mit Mock-transduzierten oder nicht transduzierten Schnitte signifikant erhöht.
