Ziel dieser Arbeit war es, sowohl eine Ressource an Arabidopsis thaliana- Proteinen zu schaffen, als auch Protein-Microarrays herzustellen und diese für funktionelle Studien einzusetzen. Als Plattform für diese funktionellen Analysen wurde die Protein-Microarray Methode gewählt. Diese Methode gehört neben den Macroarrays zu den Arraytechnolgien. In beiden Fällen werden Proteine in systematischer Anordnung auf eine Oberfläche gebunden. Diese Technologien, als Weiterentwicklung der DNA Arraytechnologien, machen nun miniaturisierte und parallelisierte funktionelle Studien von Proteinen möglich. Als Ressource zur Gewinnung von Arabidopsis thaliana-Proteinen wurden in der vorliegenden Arbeit zwei cDNA-Bibliotheken, ausgehend von mRNA aus den Geweben Pistill und Infloreszenz, hergestellt. Die Pistill cDNA-Bibliothek besteht aus 660.800 Klonen in einem GATEWAY kompatiblen Klonierungsvektor und bildet damit die Grundlage für weitere genomweite Studien in verschiedenen Expressionssystemen. Die Infloreszenz cDNA-Bibliothek (ATM1) besteht aus 40.000 Konen in einem Protein Expressionsvektor. Diese Bibliothek wurde, unter Verwendung von Hochdichte Proteinfiltern (Macroarrays), auf proteinexprimierende Klone untersucht. Ausgehend davon wurde eine Proteinexpressions-Unterbibliothek hergestellt. Dieses besteht aus 5.000 Proteinexpressionsklonen. Diese Klone wurden zur weiteren Analyse vom 5`-Ende ansequenziert. Aus diesem Expressionssubset wurde nach umfangreicher bioinformatischer Analyse ein nahezu nicht redundantes, sogenanntes Uniklonset bestehend aus 1.502 Klonen erstellt. Mit diesem nicht redundanten Set sind Analysen mit dem gleichen Informationsgehalt, wie mit der redundanten Proteinexpressions-Unterbibliothek möglich. Dieses Uniklonset (1.502 Klone) wurde für weitere Analysen um 192 vollständige cDNA-Klone erweitert. Alle 1.694 Proteine, die von den Klonen dieses Erweiterten Uniklonsets exprimiert werden, wurden in hohem Durchsatz aufgereinigt. Als eine erste funktionelle Studie dieser ca. 1.700 Arabidopsis-Proteine des Erweiterten Uniklonsets wurde die Phosphorylierung durch zwei Arabidopsis MAP-Kinasen unter Verwendung von Protein-Microarrays getestet. Nach Etablierung der ersten pflanzlichen Protein-Microarrays in unserer Arbeitsgruppe (Kersten, Feilner et al., 2003) wurde eine Protein-Microarray basierten Proteomics Methode zur Untersuchung von Gerste Proteinen entwickelt (Kramer, Feilner et al., 2004). Aufbauend auf dieser Methode wurde in der vorliegenden Arbeit ein Kinase Assay für Arabidopsis-Proteine etabliert. Dazu wurden alle ca. 1.700 gereinigten Arabidopsis-Proteine auf Nitrozellulose ähnliche beschichtete Microarrays gespottet. Diese wurden zuerst dazu verwendet, um ein Quantifizierungssystem unter Verwendung der Proteinkinase A zu etablieren, welches eine Selektion potentieller Phosphorylierungs-Targets ermöglicht. Mit diesem Quantifizierungssystem wurden dann Microarrays ausgewertet, die mit je einer der beiden Arabidopsis MAP-Kinasen 3 (MPK3) und 6 (MPK6) inkubiert worden waren. In diesen Studien wurden aus den ca. 1.700 Arabidopsis-Proteinen ca. 50 Targets der MPK3 und ca. 40 Targets der MPK6 identifiziert. Diese Ergebnisse bilden einerseits die Grundlage für zukünftige gezielte in vivo Untersuchung der neu identifizierten Targets. Andererseits kann dieser etablierte Phospholierungs-Assay auch für weitere Studien des Erweiterten Uniklonsets mit anderen Kinasen, als auch generell für Proteine anderer Herkunft genutzt werden.
Aim of this work was to develop a resource of Arabidopsis thaliana proteins as well as creating protein-microarrays for use of functional studies. Protein- microarrays were chosen as a base for these functional analyses. Besides macroarrays this method belongs to the array technologies. In both cases proteins are arrayed onto surfaced in systematic arrays. These technologies, as further enhancement of DNA array technologies, are enabling miniaturised and parallelised functional studies of proteins. To receive the resource of Arabidopsis thaliana-proteins for this work, we generated two cDNA libraries, starting from mRNA of pistil and inflorescence. The pistil cDNA-library consists of 660,800 clones in a GATEWAY compatible cloning vector and generates the base for further genome wide studies in different expression and analysis systems. The inflorescence cDNA-library (ATM1) consists of 40,000 clones in a protein expression vector. This library was examined for protein expressing clones, using high-density proteinmacroarrays. Based on this library we developed a protein expression sub-library. This sub-library consists of 5,000 protein expression clones. These clones were sequenced from the 5�-end. After extensive bioinformatics analysis we created from this expression subset a non redundant so-called unicloneset consisting of 1,502 clones. With this nonredundant set analyses are possible with the same information, as analyses with the redundant protein expression sub-library. This unicloneset (1,502 clones) was extended by 192 full length cDNA-clones for further analysis. From all 1,694 clones of the �extended unicloneset� proteins were expressed and purified in high-throughput. The first functional study of the 1,700 Arabidopsis-proteins of the extended uniclone set, was the phosphorylisation by two Arabidopsis MAP-kinases using protein-microarrays. After establishing the first plant protein-microarray (Kersten, Feilner et al., 2003), we developed a proteomic method based on protein-microarrays (Kramer, Feilner et al., 2004). Based on this method, we established a kinase assay for Arabidopsis proteins. Therefore all 1,700 purified Arabidopsis- proteins were spotted onto nitrocellulose coated microarrays surfaces. These were used to establish a quantification system using protein kinase A (PKA), which enables a selection of potential phosphorylisation targets. Microarrays which were incubated with either Arabidopsis MAP-Kinase 3 (MPK3) or 6 (MPK6) were analysed using this quantification system. In this study starting from ca. 1,700 Arabidopsis-proteins ca. 50 targets of MPK3 and ca. 40 targets of MPK6 were identified. These results are a base for in vivo research of new identified targets and the established kinase assay can be used in particular for research of the extended unicloneset with other kinases as in general for studding further proteins, independent of origin.
