dc.contributor.author
Feilner, Tanja
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:16:00Z
dc.date.available
2005-02-23T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13167
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17365
dc.description
0\. Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
1\. Einleitung 1
2\. MaterialundMethoden 20
3\. Ergebnisse 71
4\. Diskussion 113
5\. Literaturverzeichnis 136
6\. Abkuerzungsverzeichnis 146
7\. Zusammenfassung 149
8\. Summary 151
9\. Anhang 153
10\. Danksagung 170
dc.description.abstract
Ziel dieser Arbeit war es, sowohl eine Ressource an Arabidopsis thaliana-
Proteinen zu schaffen, als auch Protein-Microarrays herzustellen und diese für
funktionelle Studien einzusetzen. Als Plattform für diese funktionellen
Analysen wurde die Protein-Microarray Methode gewählt. Diese Methode gehört
neben den Macroarrays zu den Arraytechnolgien. In beiden Fällen werden
Proteine in systematischer Anordnung auf eine Oberfläche gebunden. Diese
Technologien, als Weiterentwicklung der DNA Arraytechnologien, machen nun
miniaturisierte und parallelisierte funktionelle Studien von Proteinen
möglich. Als Ressource zur Gewinnung von Arabidopsis thaliana-Proteinen wurden
in der vorliegenden Arbeit zwei cDNA-Bibliotheken, ausgehend von mRNA aus den
Geweben Pistill und Infloreszenz, hergestellt. Die Pistill cDNA-Bibliothek
besteht aus 660.800 Klonen in einem GATEWAY kompatiblen Klonierungsvektor und
bildet damit die Grundlage für weitere genomweite Studien in verschiedenen
Expressionssystemen. Die Infloreszenz cDNA-Bibliothek (ATM1) besteht aus
40.000 Konen in einem Protein Expressionsvektor. Diese Bibliothek wurde, unter
Verwendung von Hochdichte Proteinfiltern (Macroarrays), auf
proteinexprimierende Klone untersucht. Ausgehend davon wurde eine
Proteinexpressions-Unterbibliothek hergestellt. Dieses besteht aus 5.000
Proteinexpressionsklonen. Diese Klone wurden zur weiteren Analyse vom 5`-Ende
ansequenziert. Aus diesem Expressionssubset wurde nach umfangreicher
bioinformatischer Analyse ein nahezu nicht redundantes, sogenanntes Uniklonset
bestehend aus 1.502 Klonen erstellt. Mit diesem nicht redundanten Set sind
Analysen mit dem gleichen Informationsgehalt, wie mit der redundanten
Proteinexpressions-Unterbibliothek möglich. Dieses Uniklonset (1.502 Klone)
wurde für weitere Analysen um 192 vollständige cDNA-Klone erweitert. Alle
1.694 Proteine, die von den Klonen dieses Erweiterten Uniklonsets exprimiert
werden, wurden in hohem Durchsatz aufgereinigt. Als eine erste funktionelle
Studie dieser ca. 1.700 Arabidopsis-Proteine des Erweiterten Uniklonsets wurde
die Phosphorylierung durch zwei Arabidopsis MAP-Kinasen unter Verwendung von
Protein-Microarrays getestet. Nach Etablierung der ersten pflanzlichen
Protein-Microarrays in unserer Arbeitsgruppe (Kersten, Feilner et al., 2003)
wurde eine Protein-Microarray basierten Proteomics Methode zur Untersuchung
von Gerste Proteinen entwickelt (Kramer, Feilner et al., 2004). Aufbauend auf
dieser Methode wurde in der vorliegenden Arbeit ein Kinase Assay für
Arabidopsis-Proteine etabliert. Dazu wurden alle ca. 1.700 gereinigten
Arabidopsis-Proteine auf Nitrozellulose ähnliche beschichtete Microarrays
gespottet. Diese wurden zuerst dazu verwendet, um ein Quantifizierungssystem
unter Verwendung der Proteinkinase A zu etablieren, welches eine Selektion
potentieller Phosphorylierungs-Targets ermöglicht. Mit diesem
Quantifizierungssystem wurden dann Microarrays ausgewertet, die mit je einer
der beiden Arabidopsis MAP-Kinasen 3 (MPK3) und 6 (MPK6) inkubiert worden
waren. In diesen Studien wurden aus den ca. 1.700 Arabidopsis-Proteinen ca. 50
Targets der MPK3 und ca. 40 Targets der MPK6 identifiziert. Diese Ergebnisse
bilden einerseits die Grundlage für zukünftige gezielte in vivo Untersuchung
der neu identifizierten Targets. Andererseits kann dieser etablierte
Phospholierungs-Assay auch für weitere Studien des Erweiterten Uniklonsets mit
anderen Kinasen, als auch generell für Proteine anderer Herkunft genutzt
werden.
de
dc.description.abstract
Aim of this work was to develop a resource of Arabidopsis thaliana proteins as
well as creating protein-microarrays for use of functional studies. Protein-
microarrays were chosen as a base for these functional analyses. Besides
macroarrays this method belongs to the array technologies. In both cases
proteins are arrayed onto surfaced in systematic arrays. These technologies,
as further enhancement of DNA array technologies, are enabling miniaturised
and parallelised functional studies of proteins. To receive the resource of
Arabidopsis thaliana-proteins for this work, we generated two cDNA libraries,
starting from mRNA of pistil and inflorescence. The pistil cDNA-library
consists of 660,800 clones in a GATEWAY compatible cloning vector and
generates the base for further genome wide studies in different expression and
analysis systems. The inflorescence cDNA-library (ATM1) consists of 40,000
clones in a protein expression vector. This library was examined for protein
expressing clones, using high-density proteinmacroarrays. Based on this
library we developed a protein expression sub-library. This sub-library
consists of 5,000 protein expression clones. These clones were sequenced from
the 5�-end. After extensive bioinformatics analysis we created from this
expression subset a non redundant so-called unicloneset consisting of 1,502
clones. With this nonredundant set analyses are possible with the same
information, as analyses with the redundant protein expression sub-library.
This unicloneset (1,502 clones) was extended by 192 full length cDNA-clones
for further analysis. From all 1,694 clones of the �extended unicloneset�
proteins were expressed and purified in high-throughput. The first functional
study of the 1,700 Arabidopsis-proteins of the extended uniclone set, was the
phosphorylisation by two Arabidopsis MAP-kinases using protein-microarrays.
After establishing the first plant protein-microarray (Kersten, Feilner et
al., 2003), we developed a proteomic method based on protein-microarrays
(Kramer, Feilner et al., 2004). Based on this method, we established a kinase
assay for Arabidopsis proteins. Therefore all 1,700 purified Arabidopsis-
proteins were spotted onto nitrocellulose coated microarrays surfaces. These
were used to establish a quantification system using protein kinase A (PKA),
which enables a selection of potential phosphorylisation targets. Microarrays
which were incubated with either Arabidopsis MAP-Kinase 3 (MPK3) or 6 (MPK6)
were analysed using this quantification system. In this study starting from
ca. 1,700 Arabidopsis-proteins ca. 50 targets of MPK3 and ca. 40 targets of
MPK6 were identified. These results are a base for in vivo research of new
identified targets and the established kinase assay can be used in particular
for research of the extended unicloneset with other kinases as in general for
studding further proteins, independent of origin.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Arabidopsis thaliana
dc.subject
cDNA expression library
dc.subject
protein
arrays
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Hochdurchsatz Generierung und Analyse von Arabidopsis thaliana Proteinen
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Hans Lehrach
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Thomas Schmülling
dc.date.accepted
2005-02-08
dc.date.embargoEnd
2005-03-03
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2005000537
dc.title.translated
High throughput generation and analysis of Arabidopsis thaliana proteins
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000003805
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2005/53/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000003805
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open access