Zur Behandlung des akuten Leberversagens sind die therapeutischen Alternativen zur Transplantation rar. Mögliche Ansätze bieten Dialysesysteme, oder experimentelle Systeme auf Zellbasis wie die bioartifiziellen Leberunterstützungssysteme. Ihre Praktikabilität hängt mit der Verfügbarkeit von Zellkulturen eng zusammen. Es kommen hier sowohl Tumorzelllinien, als auch prim¨are porcine oder humane Hepatozyten in Frage. Da bei primären humanen Hepatozyten die Biokompatibilität am größten ist, sind sie als Zellquelle der ersten Wahl anzusehen. Leider sind die Ressourcen an primären humanen Hepatozyten gering, da sie in ausreichender Menge nur aus abgelehnten Spenderorganen isoliert werden können und in vitro nicht proliferieren. Ein Verfahren zur effektiven Nutzung und Lagerung dieser wertvollen Zellquelle ist demnach von Nutzen. Eine mögliche Strategie ist die hypotherme Lagerung der Zellkulturen bis zum Einsatz am Patienten. Leider hat die Hypothermie neben dem gewünschten Effekt der Verzögerung von Altersprozessen auch schädigende Wirkungen. Ziel dieser Studie ist, mit Hilfe eines speziellen Hypothermiemediums Kulturen von primären humanen Hepatozyten während einer 24- stündigen hypothermen Lagerung vor hypothermieinduzierten Schäden zu schützen. Für diese Arbeit wurden primäre humane Hepatozytenkulturen von n=11 Spendern verwendet. Die Isolierung erfolgte mittels Kollagenaseperfusionstechnik aus nicht pathologischen Leberstücken von 10-60g, die im Rahmen von Leberteilresektionen von dem eigentlichen Resektat abgetrennt wurden. Nach einer 24-stündigen Kultur im Brutschrank mit Standardmedium wurden Proben genommen. Für die zweiten 24 Stunden wurden die Kulturen in vier Gruppen aufgeteilt. Zwei Gruppen blieben im Brutschrank, eine erhielt Standardmedium, die andere das Testmedium (HLC1). Die beiden restlichen Gruppen wurden bei 4°C inkubiert, wieder jeweils eine mit Standardmedium und eine mit HLC1. Nach dieser Zeitspanne erfolgte die zweite Probenentnahme. Am dritten Kulturtag wurden alle Gruppen wieder mit Standardmedium im Brutschrank inkubiert, um Schäden zu detektieren, die typischerweise während der Wiedererwärmung auftreten. Am Ende dieses Tages erfolgte die letzte Probenentnahme. Es wurden für jeden Zeitpunkt und jede Versuchsgruppe unterschiedliche Parameter analysiert (Gesamtprotein, LDH, AST, Harnstoff, Albumin, Zellaktivität) und am Ende des Versuchs lichtmikroskopische Bilder der Zellkulturen angefertigt. Nach der abschließenden Rekulturphase hat die ungeschützt in der Kälte inkubierte Gruppe das niedrigste Niveau der Syntheseparameter und eine hohe Aktivität von Enzymen im Kulturmedium, jeweils als Ausdruck einer massiven Schädigung der Kulturen. Die geschützten Kaltkulturen weisen höhere Enzymaktivitäten als die warme Standardkultur auf, in den Syntheseleistungen sind allerdings keine signifikanten Unterschiede sichtbar. Die imWarmen mit Hypothermiemedium inkubierten Zellen weisen massive Schäden und produzieren in der Rekulturphase signifikant weniger Albumin und Harnstoff als die kaltinkubierte Gruppe mit dem gleichen Medium. Die ungeschützte Kaltgruppe ist in ihrem gesamten Profil im Vergleich mit der geschützten Kaltgruppe als klar unterlegen anzusehen. Die geschützte Kaltgruppe kommt der Standardkultur aufgrund ihrer guten Synthesefunktionen recht nahe. Die hier vorgestellten Ergebnisse belegen, dass eine effektive Minderung der kälteinduzierten Schädigung in Kulturen von primären humanen Hepatozyten durch den Einsatz von HLC1 Medium im 24-Stunden-Modell möglich ist. Die geschützten Kulturen zeigen sich nach Kaltinkubation den ungeschützen deutlich überlegen, erreichen aber nicht ganz das Niveau der durchgehend warm inkubierten Zellkulturen. Die Versuchsdauer ist in diesem Modell noch zu kurz gewählt und müsste für eine effektive Nutzung des Verfahrens sicherlich verlängert werden. Es bieten sich aber sowohl im Versuchsaufbau als auch pharmakologisch noch zahlreiche Möglichkeiten und Maßnahmen zur Verbesserung des Kulturergebnisses an.
While transplantation is the only curative therapy for most cases of acute liver failure, the lack of donor organs encourages research towards alternative therapeutic methods. Current approaches include cell based bioartificial support systems or cell transplantation for bridging-to- transplantation or even bridging-to-recovery. Since cultured primary human hepatocytes loose metabolic function within the first weeks of culture, methods for cell preservation are desireable. Cell cultivation under hypothermic conditions presents a simple method to maintain cell metabolic function over extended time periods. Hypothermia and subsequent rewarming is known to have adverse effects on cell viability. Here we present results showing protection of primary human hepatocytes exposed to hypothermia for 24 hours using medium specifically designed for hypothermic incubation. Cultures of primary human hepatocytes isolated (n=11) by collagenase-perfusion were cultured for three days in four different study groups. On days one and three all cells were kept under standard culture conditions at 37°C. On day two the experimental groups were kept at 4°C. Cells exposed to hypothermia were either cultured in standard medium or in medium containing iron-chelators (i.e. phenanthroline, 2`2-dipyridyl) and antioxidants such as glutathione, L-carnosine and L-cysteine. Medium supernatant samples and protein samples were taken daily from every study group and tested for albumin, urea, AST and total protein content. Cells cultured in protective medium which were exposed to hypothermia showed just 8% of the AST-activities in their medium supernatant compared to the unprotected group during cold incubation. After rewarming the protected cells secreted 30% more urea as the unprotected cultures did and showed no significant difference confered to the standard culture. Total protein levels on day three matched to day one were 86% in standard cultures, 72% in protected and 53% in unprotected cold groups. These results suggest that hypothermic stand-by cultures may offer an effective method for the timely provision of primary human hepatocytes for clinical application.
