dc.contributor.author
Modest, Dominik Paul
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:13:19Z
dc.date.available
2009-07-06T12:06:58.230Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13099
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17297
dc.description.abstract
Zur Behandlung des akuten Leberversagens sind die therapeutischen Alternativen
zur Transplantation rar. Mögliche Ansätze bieten Dialysesysteme, oder
experimentelle Systeme auf Zellbasis wie die bioartifiziellen
Leberunterstützungssysteme. Ihre Praktikabilität hängt mit der Verfügbarkeit
von Zellkulturen eng zusammen. Es kommen hier sowohl Tumorzelllinien, als auch
prim¨are porcine oder humane Hepatozyten in Frage. Da bei primären humanen
Hepatozyten die Biokompatibilität am größten ist, sind sie als Zellquelle der
ersten Wahl anzusehen. Leider sind die Ressourcen an primären humanen
Hepatozyten gering, da sie in ausreichender Menge nur aus abgelehnten
Spenderorganen isoliert werden können und in vitro nicht proliferieren. Ein
Verfahren zur effektiven Nutzung und Lagerung dieser wertvollen Zellquelle ist
demnach von Nutzen. Eine mögliche Strategie ist die hypotherme Lagerung der
Zellkulturen bis zum Einsatz am Patienten. Leider hat die Hypothermie neben
dem gewünschten Effekt der Verzögerung von Altersprozessen auch schädigende
Wirkungen. Ziel dieser Studie ist, mit Hilfe eines speziellen
Hypothermiemediums Kulturen von primären humanen Hepatozyten während einer 24-
stündigen hypothermen Lagerung vor hypothermieinduzierten Schäden zu schützen.
Für diese Arbeit wurden primäre humane Hepatozytenkulturen von n=11 Spendern
verwendet. Die Isolierung erfolgte mittels Kollagenaseperfusionstechnik aus
nicht pathologischen Leberstücken von 10-60g, die im Rahmen von
Leberteilresektionen von dem eigentlichen Resektat abgetrennt wurden. Nach
einer 24-stündigen Kultur im Brutschrank mit Standardmedium wurden Proben
genommen. Für die zweiten 24 Stunden wurden die Kulturen in vier Gruppen
aufgeteilt. Zwei Gruppen blieben im Brutschrank, eine erhielt Standardmedium,
die andere das Testmedium (HLC1). Die beiden restlichen Gruppen wurden bei 4°C
inkubiert, wieder jeweils eine mit Standardmedium und eine mit HLC1. Nach
dieser Zeitspanne erfolgte die zweite Probenentnahme. Am dritten Kulturtag
wurden alle Gruppen wieder mit Standardmedium im Brutschrank inkubiert, um
Schäden zu detektieren, die typischerweise während der Wiedererwärmung
auftreten. Am Ende dieses Tages erfolgte die letzte Probenentnahme. Es wurden
für jeden Zeitpunkt und jede Versuchsgruppe unterschiedliche Parameter
analysiert (Gesamtprotein, LDH, AST, Harnstoff, Albumin, Zellaktivität) und am
Ende des Versuchs lichtmikroskopische Bilder der Zellkulturen angefertigt.
Nach der abschließenden Rekulturphase hat die ungeschützt in der Kälte
inkubierte Gruppe das niedrigste Niveau der Syntheseparameter und eine hohe
Aktivität von Enzymen im Kulturmedium, jeweils als Ausdruck einer massiven
Schädigung der Kulturen. Die geschützten Kaltkulturen weisen höhere
Enzymaktivitäten als die warme Standardkultur auf, in den Syntheseleistungen
sind allerdings keine signifikanten Unterschiede sichtbar. Die imWarmen mit
Hypothermiemedium inkubierten Zellen weisen massive Schäden und produzieren in
der Rekulturphase signifikant weniger Albumin und Harnstoff als die
kaltinkubierte Gruppe mit dem gleichen Medium. Die ungeschützte Kaltgruppe ist
in ihrem gesamten Profil im Vergleich mit der geschützten Kaltgruppe als klar
unterlegen anzusehen. Die geschützte Kaltgruppe kommt der Standardkultur
aufgrund ihrer guten Synthesefunktionen recht nahe. Die hier vorgestellten
Ergebnisse belegen, dass eine effektive Minderung der kälteinduzierten
Schädigung in Kulturen von primären humanen Hepatozyten durch den Einsatz von
HLC1 Medium im 24-Stunden-Modell möglich ist. Die geschützten Kulturen zeigen
sich nach Kaltinkubation den ungeschützen deutlich überlegen, erreichen aber
nicht ganz das Niveau der durchgehend warm inkubierten Zellkulturen. Die
Versuchsdauer ist in diesem Modell noch zu kurz gewählt und müsste für eine
effektive Nutzung des Verfahrens sicherlich verlängert werden. Es bieten sich
aber sowohl im Versuchsaufbau als auch pharmakologisch noch zahlreiche
Möglichkeiten und Maßnahmen zur Verbesserung des Kulturergebnisses an.
de
dc.description.abstract
While transplantation is the only curative therapy for most cases of acute
liver failure, the lack of donor organs encourages research towards
alternative therapeutic methods. Current approaches include cell based
bioartificial support systems or cell transplantation for bridging-to-
transplantation or even bridging-to-recovery. Since cultured primary human
hepatocytes loose metabolic function within the first weeks of culture,
methods for cell preservation are desireable. Cell cultivation under
hypothermic conditions presents a simple method to maintain cell metabolic
function over extended time periods. Hypothermia and subsequent rewarming is
known to have adverse effects on cell viability. Here we present results
showing protection of primary human hepatocytes exposed to hypothermia for 24
hours using medium specifically designed for hypothermic incubation. Cultures
of primary human hepatocytes isolated (n=11) by collagenase-perfusion were
cultured for three days in four different study groups. On days one and three
all cells were kept under standard culture conditions at 37°C. On day two the
experimental groups were kept at 4°C. Cells exposed to hypothermia were either
cultured in standard medium or in medium containing iron-chelators (i.e.
phenanthroline, 2`2-dipyridyl) and antioxidants such as glutathione,
L-carnosine and L-cysteine. Medium supernatant samples and protein samples
were taken daily from every study group and tested for albumin, urea, AST and
total protein content. Cells cultured in protective medium which were exposed
to hypothermia showed just 8% of the AST-activities in their medium
supernatant compared to the unprotected group during cold incubation. After
rewarming the protected cells secreted 30% more urea as the unprotected
cultures did and showed no significant difference confered to the standard
culture. Total protein levels on day three matched to day one were 86% in
standard cultures, 72% in protected and 53% in unprotected cold groups. These
results suggest that hypothermic stand-by cultures may offer an effective
method for the timely provision of primary human hepatocytes for clinical
application.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Schutz vor hypothermer Schädigung in Kulturen von primären humanen Hepatozyten
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. med. P. Neuhaus
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. med. S. Jonas, PD Dr. med. H. Gebhardt
dc.date.accepted
2009-09-18
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000010802-4
dc.title.translated
Protection against hypothermic-induced damage in cultures of primary human
hepatocytes
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000010802
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000005804
dcterms.accessRights.dnb
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open access