Einleitung: Das kolorektale Karzinom ist einer der häufigsten malignen Tumore und in Deutschland die zweithäufigste Krebstodesursache. Ein wesentlicher Faktor in der Progression maligner Neoplasien ist die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen durch Anschluss an das körpereigene Gefäßsystem. Die Aktivierung der Angiogenese durch Umschalten des „angiogenetischen Switches“ wird durch verschiedene Signaltransduktionswege gesteuert. Monoklonale Antikörper gegen pro-angiogenetische Faktoren werden in der Therapie des kolorektalen Karzinoms bereits eingesetzt. Das System der Robo- Rezeptoren und ihrer Slit-Liganden ist an Angiogenese- Mechanismen beteiligt und konnte als differentiell exprimiert in verschiedenen Tumorgeweben nachgewiesen werden. In Untersuchungen der eigenen Arbeitsgruppe konnten mittels DNA- Chiparray Analyse Robo1, Robo4 und Slit2 als differentiell exprimiert beim kolorektalen Karzi- nom nachgewiesen werden. Ziel dieser Studie war die Validierung der differentiellen Expression mittels Real-Time Fluores- zenz PCR und Analyse der Expression von Robo1, Robo4 und Slit2 in situ im Gewebe sowie die Bewertung eines potentiellen Ziels einer antiproliferativen bzw. anti-angiogenetischen Tumortherapie. Material und Methoden: Von 50 Patienten wurden postoperativ Proben von kolorektalem Tumor- und Normalgewebe kryoasserviert und makrodisseziert. Nach RNA-Isolierung und reverser Transkription wurde die quantitative Analyse der Genexpression von Robo1, Robo4 und Slit2 mittels Real-time PCR durchgeführt. Hierzu wurden spezifische Hybridisierungssonden eingesetzt, wobei als Referenz- gen β-2-Mikroglobulin verwendet wurde. Die Expressionsdaten wurden mit dem Algorithmus der Relative Quantification Software ausgewertet. Für den histologischen Nachweis auf Paraffin- Gewebeschnitten wurden die Methoden der Immunhistochemie (IHC) bzw. In-Situ Hybridisie- rung (ISH) herangezogen. Die IHC und ISH wurde mittels einer Intensitätsskala bewertet. Dabei entsprach der Wert (+++) einer starken Anfärbung, der Wert (++) einer moderaten Anfärbung, der Wert (+) einer geringen Anfärbung und der Wert (+/-) einer nicht eindeutigen Färbung. Die Methoden der Real-Time PCR und der IHC wurden mittels der Spearman-Korrelationsanalyse auf Vergleichbarkeit geprüft. Dazu wurde die IHC Anfärbungsskala in einen Rangfolgenscore transformiert mit den Zahlenwerten 3 (+++), 2 (++), 1 (+) und 0,5 (+/-). Ergebnisse: Robo1 zeigte in der Real-Time PCR eine signifikante Überexpression bei 78% (39/50) der Pati- enten im Tumorepithel gegenüber dem Normalepithel. Robo4 ließ sich in 72% (36/50) der Patentenproben als überexprimiert im Tumorepithel nachweisen. In 68% (34/50) der Patientenprobenpaare war Slit2 im Tumorgewebe niedriger exprimiert als im Normalgewebe. Ein signifikanter Unterschied zwischen den einzelnen UICC-Stadien und insbesondere zwischen den metasta- tischen Stadien UICC III/IV und den nicht metastatischen Stadien UICC I/II ließ sich weder für Robo1, Robo4 noch Slit2 ermitteln. Die IHC zeigte für Robo1 eine starke Expression in Tumorepithelzellen und Tumorgefäßen, wohingegen das Normalgewebe nur schwach angefärbt wurde. In der ISH ließ sich Robo1 sowohl in Tumorzellen als auch in den angrenzenden Gefäßstrukturen nachweisen. Robo4 zeigte in der Immunhistochemie und In-Situ Hybridisierung ausschließlich eine Anfärbung der Tumorendothelien. Slit2 zeigte immunhistochemisch kein spezifisches Färbungsmuster. Eine stärkere Anfärbung von Tumor- oder Normalgewebe ließ sich nicht ermitteln. Die Korrelationsanalyse ergab für die Real-Time PCR und IHC für Robo1 einen schwachen signifikanten Zusammenhang, für Robo4 einen schwachen signifikanten Zusammenhang und für Slit2 keinen signifikanten Zusammenhang. Schlussfolgerung: Die Überexpression von Robo1 und Robo4 im Tumor gegenüber Normalgewebe konnte mittels Real-Time PCR bestätigt werden. Robo1 und Robo4 sind damit als Tumoronkogene beim kolorektalen Karzinom anzusehen. Slit 2 zeigt eine herunter regulierte Expression im Tumorgewebe und damit das RNA-Expressionsmuster eines Tumorsuppressorgens jedoch ohne Bestätigung durch IHC. Robo1 zeigt in der IHC keine spezifische Gewebeanfärbung jedoch eine deutlich höhere Färbungsintensität im Tumorgewebe. Diese Tatsache bietet Potential für weitere Untersuchungen im Hinblick auf die Tumorbiologie des kolorektalen Karzinoms und Möglichkeiten der therapeutischen Intervention. Die histologischen Gewebeanalysen haben insbesondere für Robo4 eine spezifische Expression in den Tumorgefäßen gezeigt. Robo4 stellt durch seine Gewebespezifität und einer direkten Beteiligung an der Angiogenese ein potentielles Ziel einer antiproliferativen bzw. anti-angiogenetischen Tumortherapie beim kolorektalen Karzinom dar.
Introduction: Colorectal cancer is one of the most common malignant tumors and in Germany the second most common cause of cancer death. A key factor in the progression of malignant neoplasms is the supply of oxygen and nutrients by connecting to the body's vascular system. The activation of angiogenesis by toggling the "angiogenic switch"is controlled by different signal transduction pathways. Monoclonal antibodies against pro-angiogenic factors are used already in the treatment of colorectal cancer. The system of Robo-Slit receptors and their ligands is involved in angiogenesis mechanisms and could be detected as differentially expressed in various tumor tissues. In previous studies of the working group Robo1, Robo4 and Slit2 were detected as differentially expressed in colorectal cancer by DNA chip array analysis . The aim of this study was to validate the differential expression by real-time fluorescence PCR and analysis of the expression of Robo1, Robo4 Slit2 in the tissue and the evaluation of a potential target of anti-proliferative and anti-angiogenic tumor therapy. Material and methods: Postoperatively samples of colorectal tumor and normal tissue of 50 patients were kryoasserved and makrodissected. After RNA isolation and reverse transcription quantitative analysis of gene expression of Robo1, Robo4 and Slit2 by real-time PCR was performed. For this purpose, specific hybridization probes were used. β-2 microglobulin was used as the reference gene. The expression data were analyzed using the algorithm of the Relative Quantification Software. For the histological detection on paraffin tissue sections, the methods of immunohistochemistry (IHC) and in situ hybridization (ISH) were used. The IHC and ISH were estimated using an intensity scale. In this case, the value of a strong (+++) staining, the value (+ +) moderate staining, the value (+) staining and a low value (+/-) of a non-unique coloring. The methods of the Real-Time PCR and IHC were tested by the Spearman correlation analysis for correlation. Therefore the IHC scale was transformed into a ranking score with the numerical values 3 (+++), 2 (++), 1 (+) and 0.5 (+/-). Results: Robo1 showed in real-time PCR, a significant over-expression in 78% (39/50) of the patients in tumorepithel against the normal-tissue. Robo4 could be detected as overexpressed in 72% (36/50) of the patient tumor tissue. In 68% (34/50) of patients samples Slit2 was expressed lower in tumor tissue than in normal tissue. A significant difference between the UICC stages and in particular between the metastatic UICC stages III / IV and non-metastatic stages UICC I / II was determined neither for Robo1, Robo4 Slit2 yet. The IHC showed a strong expression of Robo1 in tumor cells and tumor vessels, whereas the normal tissue was stained only weakly. In the ISH Robo1 was detected in tumor cells and in the adjacent vascular structures. Robo4 showed in immunohistochemistry and in situ hybridization exclusive staining of the tumor vascular structures. Slit2 immunohistochemistry showed no specific staining pattern. A stronger staining of tumor or normal tissue could not be ascertained. The correlation analysis showed for the Real-Time PCR and IHC for Robo1 a weak significant association, for Robo4 a weak significant connection and for Slit2 no significant relationship. Conclusion: The overexpression of Robo1 and Robo4 in the tumor compared with normal tissue was confirmed by real-time PCR. Robo1 and Robo4 are to be regarded as tumoroncogenes in colorectal carcinoma. Slit 2 showed a down-regulated expression in the tumor tissue and thus the RNA expression pattern of a tumor suppressor gene, however, without confirmation by IHC. Robo1 in the IHC shows no specific tissue staining however, a significantly higher staining intensity in tumor tissue. This fact offers potential for further investigations in view of the tumor biology of colorectal cancer and possibilities of therapeutic intervention. The histological tissue studies have shown particular Robo4 specific expression in the tumor vessels. Robo4 is a potential target of anti-proliferative and anti- angiogenic tumor therapy in colorectal cancer, through its tissue specificity and a direct involvement in angiogenesis
