A-kinase anchoring proteins (AKAPs) localise the cAMP-dependent protein kinase A (PKA) to distinct cellular compartments and thereby facilitate access to PKA substrates in close vicinity. In addition, AKAPs bind other signalling proteins, allowing for the integration of cAMP signalling with other signalling pathways in a temporally and spatially controlled manner. GSK3β interaction protein (GSKIP) had been identified in a database screen as a novel AKAP and had been shown to bind regulatory RII subunits of PKA in vitro. In this thesis, the AKAP function of GSKIP was demonstrated in live cells by cAMP agarose pull-down experiments and by fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS). In addition, it was shown that GSKIP is a ubiquitously expressed, cytosolic AKAP that forms a complex with PKA RIIα and GSK3β in vitro as determined by enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Moreover, GSKIP was found to increase the PKA-dependent phosphorylation of GSK3β serine-9 and thus inhibition of GSK3β. GSKIP is highly conserved among fungi, invertebrates and vertebrates. In a peptide spot array-based approach, the potential RII- and GSK3β-interaction domains of GSKIP orthologues were tested for RIIα and GSK3β binding, respectively. The interaction with RIIα and thus an AKAP function was only observed in vertebrate orthologues of GSKIP. In contrast, the binding to GSK3β was found for most of the peptides derived from fungal, invertebrate and vertebrate GSKIP proteins. In order to develop a basis for the elucidation of the physiological function of GSKIP, a mouse model for the conditional knockout of GSKIP was developed during this thesis. Genomic mouse DNA containing the GSKIP coding sequence was used to generate a targeting vector in which exon 2 of the GSKIP gene was flanked by loxP sites (floxed). This allowed a Cre-catalysed removal of exon 2 and thereby a disruption of the gene. The targeting vector was site-specifically integrated into the genome of embryonic stem (ES) cells. Recombinant ES cells were injected into mouse embryos which developed into mice carrying a floxed GSKIP allele. The genetic modification was inherited to filial generations and by breeding to a Cre-expressing mouse strain, the floxed sequence containing exon 2 was removed. The resulting GSKIP+/- mice were viable and fertile. Male and female GSKIP+/- mice were crossed but did not yield GSKIP / offspring, implying that a homozygous deletion of GSKIP is embryonically lethal. In future experiments, a detailed phenotypic analysis of GSKIP knockout mice will be performed with the prospect of gaining insight into the cause of embryonic lethality and into the physiological function of GSKIP.
A-Kinase-Ankerproteine (AKAP) binden die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA) durch direkte Proteininteraktion in spezifischen zellulären Kompartimenten. Dadurch wird die Phosphorylierung nahe gelegener Substrate ermöglicht. Außerdem interagieren AKAP direkt mit weiteren Signalproteinen und können so räumlich und zeitlich verschiedene Signalwege integrieren. In einer in unserer Arbeitsgruppe durchgeführten Datenbanksuche wurde das GSK3β interaction protein (GSKIP) als neues AKAP identifiziert. Seine AKAP-Funktion (Interaktion mit regulatorischen RII-Untereinheiten der PKA) wurde in vitro nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde die AKAP-Funktion von GSKIP durch cAMP- Agarose-Präzipitationen und durch Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Spektroskopie erstmals auch in lebenden Zellen nachgewiesen. Es wurde gezeigt, dass GSKIP ein ubiquitär exprimiertes, zytosolisches AKAP ist, das in vitro einen Komplex mit der RIIα-Untereinheit der PKA und der GSK3β bildet. Weiterhin wurde festgestellt, dass GSKIP in Zellen zu einer Erhöhung der PKA-abhängigen inhibitorischen Phosphorylierung der GSK3β führt. GSKIP ist evolutionär konserviert. Die den RII- und GSK3β-Bindedomänen entsprechenden Regionen verschiedener Orthologe von GSKIP wurden als Peptid-Spots synthetisiert und hinsichtlich einer RIIα- bzw. GSK3β-Bindung untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die Interaktion mit GSK3β in GSKIP-Orthologen aus Pilzen, Invertebraten und Vertebraten konserviert ist. Die RIIα-Bindung hingegen wurde nur für Vertebraten gezeigt. Als Basis für die Aufklärung der physiologischen Funktion von GSKIP wurde in dieser Arbeit ein konditionelles GSKIP-knockout- Mausmodell generiert. Genomische DNA aus der Maus, welche die GSKIP-kodierende Sequenz enthält, wurde für die Klonierung eines Targeting-Vektors verwendet, in dem das Exon 2 des GSKIP-Gens von loxP-Sequenzen flankiert (gefloxt) wurde. Diese ermöglichten eine von der Cre-Rekombinase katalysierte Inaktivierung des Gens. Der Targeting-Vektor wurde sequenzspezifisch in das Genom embryonaler Stamm- (ES)-Zellen integriert. Rekombinante ES-Zellen wurden in Mausembryonen injiziert, aus denen sich Mäuse mit einem gefloxten GSKIP-Allel entwickelten. Diese genetische Modifikation wurde an Folgegenerationen vererbt. Durch das Verpaaren mit einem Cre-Rekombinase exprimierenden Mausstamm wurde die gefloxte Sequenz entfernt. Die resultierenden GSKIP+/--Mäuse waren lebens- und fortpflanzungsfähig. Allerdings brachten GSKIP+/- × GSKIP+/--Verpaarungen keine GSKIP-/--Nachkommen hervor, was auf eine embryonale Lethalität der homozygoten Gendeletion hindeutet. Zukünftig soll eine detaillierte Analyse des Phänotyps der GSKIP-knockout-Maus erfolgen, um die Ursache der embryonalen Lethalität und die physiologische Funktion von GSKIP aufzuklären.