Zinc is a micronutrient required for numerous cellular functions in all living organisms. In recent years, zinc as an alternative additive is increasingly used in farmed animals to enhance growth performance, as it is able to prevent or reduce the duration and severity of diarrhea caused by some pathogens, especially pathogenic E. coli. It has been reported that zinc supplementation also leads to an increased rate of antibiotic resistance in commensal E. coli. However, until now the underlying mechanisms of these effects driven by zinc exposure have remained unclear. In our studies, we characterized two E. coli strains, commensal strain IMT29408 and pathogenic strain IMT8073 (aEPEC) defined by genotypic analysis, as representatives of porcine intestinal E. coli to investigate zinc sensitivity, the effects of zinc on growth rates, intracellular zinc content of commensal strain in vitro and protein expression differences induced by zinc. Since there is only limited available knowledge about laboratory strains (K-12) instead of wild-type strains that are highly different in gene content and consequent physiological properties compared to lab strains. In the present study, the bacteria were cultured in LB medium using a bioreactor under anaerobic condition with or without 1 mM zinc chloride determined on the basis of minimal inhibitory concentration test. There were no significantly inhibitory influences of zinc on cell viability represented by CFU per milliliter and cell turbidity represented by OD600 values from 1 h to 7 h in commensal strain IMT29408. By contrast, although the cell viability of aEPEC IMT8073 was not significantly decreased by zinc, the bacteria turbidities were reduced by zinc treatment from 1 h to 7 h. These indicated that the inhibition of aEPEC virulence was likely not induced by the reduction in bacterial viability, but rather by changes in cell physiology. In the commensal strain IMT29408, we investigated how the intracellular zinc content changes in the presence or absence of 1 mM zinc over time. The results showed that from 0 h to 10 h of incubation, the intracellular zinc content was about 8.6 x 10(6) atoms/cell in average with a maximum of 1.2 x 10(7) atoms/cell at 2 h in the presence of zinc, while cultured in the control (LB medium), the average value was about 1.1 x 10(5) atoms/cell with a peak amount of 4.5 x 10(5) atoms/cell at 3 h. The results suggested that the intracellular zinc content in commensal E. coli varies significantly with the changes in environmental zinc availability and exposure time. Based on the growth rates and intracellular zinc content curves over time, bacterial samples were collected at 2 h and 5 h time points for proteomic analysis to investigate the differences of protein expression between zinc treatment and control. In commensal E. coli IMT29408, proteomic analysis using 2D-DIGE revealed 544 protein spots in total. We identified two differentially expressed (>1.5-fold change, p<0.05 (student’s t test)) proteins up-regulated (DegP and FabF) and seven proteins down-regulated (ManX, Mdh, Pgk, RbsB, RpoA, Tsf and YhdH) at 2 h of incubation with zinc using MALDI-TOF MS/MS. At 5 h of incubation, there were seven up-regulated (DegP, FabF, RplD, TnaA, TpiA, Tsx and YchF) and three down-regulated (AhpC, RffG and PflB) proteins identified. Most of them have not previously been implicated in responding to zinc compared with the available data about E. coli K-12, which are mainly involved in translation, stress defense, glycolysis and transport. We also identified the differentially expressed proteins only influenced by continuous zinc treatment (from 2 h to 5 h), six up-regulated and fourteen down-regulated. Among these, two porins OmpC and OmpX were down-regulated, which suggested that persistent zinc treatment could result in reduced outer membrane permeability. These data give evidence that reduced outer membrane permeability is a possible explanation for the zinc-induced antibiotic resistance. In pathogenic E. coli IMT8073, there were 413 protein spots detected by 2D-DIGE. Out of them, at 2 h of incubation we identified two up-regulated proteins (KatE and ClpB), while at 5 h, there were eleven up-regulated (AccC, AsnS, AspA, AtpA, AtpD, DegP, FabF, HybC, PyrG, TnaA and Tsf) and six down-regulated (CadA, MinD, NanA, NusA, PflB and Udp) proteins identified. From these identified proteins, we concluded that pathogenic E. coli adapted to zinc stress by up-regulation of proteins associated with oxidative stress defense, translation, and energy generation (ATP synthesis, glycolysis, and anaerobic respiration) as a survival strategy. We also identified eight up-regulated and twenty-six down- regulated proteins only influenced by zinc when comparing 2 h to 5 h of incubation. Most of these proteins were involved in translation (PrfB and LysS up-regulated while Tuf, GlyS, TypA, RplI and GlnS down-regulated), metabolic processes (GlpQ, GlnA and AspA up-regulated while FbaA, Pta, TdcE, PflB, MinD, Gnd, CadA, PspE and EutD down-regulated) and biosynthetic processes (PdxJ up- regulated while FabF, GlmS and HemX down-regulated). Of these proteins, TypA, a regulatory protein was down-regulated and this suggested that persistent zinc treatment probably influenced EPEC virulence, as typA-mutants of EPEC showed declined adherence to cultured cells. Based on these results, it was indicated that the antibacterial effects of zinc on EPEC are likely achieved by a combination of multiple physiological mechanisms such as oxidative stress, envelope stress and metabolic influences, which might be a possible explanation for previous findings that zinc treatment reduces virulence of EPEC. Comparatively, the differentially expressed proteins influenced by zinc were mostly different among the wild-type E. coli strains (commensal and pathogenic) in the present study as well as the E. coli K-12 described previously. This indicated that the metabolic strategies for adaptation of zinc stress vary among these strains, which is probably due to the different number of protein-coding genes involved in physiological activities.
Zink ist ein Spurenelement, das für zahlreiche zelluläre Funktionen in allen lebenden Organismen benötigt wird. In den letzten Jahren nahm die Verwendung von Zink als Alternative zu antibiotischen Leistungsfördereru als Futterzusatz in der landwirtschaftlichen Tierhaltung zu, um vor allem das Wachstum der Tiere zu fördern. Es wird außerdem angenommen, dass Durchfallerkrankungen, die durch Pathogene und zwar speziell durch E. coli verursacht warden, durch die Zugabe von Zink verhindert oder die Dauer und der schwere Verlauf abgemildert werden können. Andererseits wurde berichtet, dass die Zugabe von Zink zu einem höheren Auftreten von Antibiotikaresistenzen in kommensalen E. coli führt. Bislang sind die dafür verantwortlichen Mechanismen unklar. In unseren Untersuchungen haben wir zwei E. coli Stämme charakterisiert, den kommensalen Stamm IMT29408 und den pathogenen Stamm IMT8073 (aEPEC), welche durch eine genotypische Analyse definiert wurden. Die Stämme wurden repräsentativ für porzine intestinale E. coli ausgewählt um die Zinksensivität, die Effekte von Zink auf die E. coli Wachstumsrate, die intrazelluläre Zinkkonzentration und die Unterschiede in der Proteinexpression, welche durch Zink induziert werden, zu untersuchen. Bisherige Zink-abhängige Proteinexpressionsstudien konzentrierten sich auf E. coli K-12 Laborstämme. Diese Stämme unterscheiden sich jedoch enorm von Wildtyp-Stämmen - sowohl bezüglich Genomgröße als auch der dadurch bedingten physiologischen Eigenschaften. Daher können die bekannten K-12- abhängigen Ergebnisse nicht auf Wildtyp-Stämme übertragen werden. In der aktuellen Studie wurden die E. coli Stämme in LB Medium mit/ohne 1mM Zinkchlorid anaerob in einem Biorektor kultiviert. Die verwendete Konzentration wurde mittels minimalen Hemmkonzentrationstests bestimmt. Es gab keine signifikanten inhibitorischen Einflüsse von Zink auf die Zellvitalität (KBE pro Milliliter) und Zelldichte (OD600nm Werte von 1-7 Stunden) im kommensalen Stamm IMT29408. Die Zellvitalität des aEPEC Stamms wurde auch nicht signifikant durch Zink beeinflusst. Jedoch war die Bakteriendichte signifikant durch die Kultivierung mit Zink reduziert. Dies könnte darauf hinweisen, dass die Virulenz von aEPEC weder durch die Reduktion der Vitalität noch durch Veränderungen in der Zellmorphologie oder Physiologie inhibiert wird. Die Untersuchung des intrazellulären Zinkgehalts in An- und Abwesenheit von Zink im kommensalen Stamm IMT29408 ergab, dass während der Kultivierung mit Zink der intrazelluläre Zinkgehalt durchschnittlich bei 8,6 x 10(6) Atomen/Zelle lag. Er erreichte sein Maximum nach zwei Stunden mit 1,2 x 10(7) Atomen/Zelle. Bei der Kultivierung ohne Zink im reinen LB-Medium lag der Mittelwert bei 1,1 x 10(5) Atomen/Zelle mit einem Höchstwert von 4,5 x 10(5) Atomen/Zelle. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die intrazelluläre Zinkkonzentration in kommensalen E. coli signifikant mit den Veränderungen in der Verfügbarkeit von Zink in der Umwelt und dem Zeitraum, dem es Zink ausgesetzt ist, variiert. Basierend auf den zeitabhängigen Wachstumsraten und der intrazellulären Zinkkonzentration wurden Proben nach 2 und 5 Stunden für die Proteomanalyse gewonnen, um Unterschiede in der Proteinexpression zwischen den Gruppen der Zinkbehandlung und Kontrolle zu messen. Die Proteomanalyse des kommensalen E. coli IMT29408 mit 2D-DIGE und MALDI-TOF MS/MS zeigte 544 Proteinspots auf. Darunter konnten wir Proteine identifizieren, die unterschiedlich exprimiert werden (>1.5-fold change, p<0.05 (student’s t test)). Es gab zwei Proteine, die nach zwei Stunden induziert (DegP und FabF) und sieben Proteine, die reprimiert waren (ManX, Mdh, Pgk, RbsB, RpoA, Tsf und YhdH). Nach einer Inkubationszeit von fünf Stunden waren sieben Proteine induziert (DegP, FabF, RplD, TnaA, TpiA, Tsx und YchF) und drei reprimiert (AhpC, RffG und PflB). Die meisten dieser Proteine sind bislang nicht bekannt dafür auf Zink zu reagieren, beruhend auf den Daten mit E. coli K-12. Die genannten Proteine sind hauptsächlich involviert in der Translation, der Stessantwort, der Glykolyse und dem Transport. Wir konnten ebenfalls Proteine identifizieren, die nur durch Zink beeinflusst wurden (nach zwei und fünf Stunden). Es waren sechs induzierte und 14 reprimierte Proteine. Unter diesen waren auch die zwei Porine OmpC und OmpX reprimiert. Dies führt uns zu der Annahme, dass eine andauernde Zinkbehandlung in einer reduzierten äußeren Membranpermeabilität resultiert. Diese Daten könnten somit einen Hinweis für einen möglichen Mechanismus für die zinkinduzierte Antibiotikaresistenz liefern. Für den aEPEC Stamm IMT8073 konnten insgesamt 413 Proteinspots durch die 2D-DIGE detektiert werden. Nach zwei Stunden Inkubation waren zwei Proteine induziert (KatE und ClpB), während nach fünf Stunden elf Proteine induziert (AccC, AsnS, AspA, AtpA, AtpD, DegP, FabF, HybC, PyrG, TnaA und Tsf) und sechs reprimiert waren (CadA, MinD, NanA, NusA, PflB und Udp). Die Identifizierung dieser Proteine lässt die Annahme zu, dass pathogene E. coli sich an die hohe Zinkkonzentration adaptieren können durch Hochregulierung von Proteinen, die mit oxidativer Stressantwort, Translation und Energiegeneration (ATP Synthese, Glykolyse und anaerobische Atmung) assoziiert sind und dies als eine Überlebensstrategie nutzen. Zudem wurden acht induzierte und 26 reprimierte Proteine durch den Einfluss von Zink identifiziert (nach zwei und fünf Stunden Kultivierung mit Zink). Die meisten von diesen Proteinen sind in der Translation (PrfB und LysS induziert während Tuf, GlyS, TypA, RplI und GlnS reprimiert), metabolischen Prozessen (GlpQ, GlnA und AspA induziert während FbaA, Pta, TdcE, PflB, MinD, Gnd, CadA, PspE und EutD reprimiert) und biosynthetischen Prozessen involviert (PdxJ induziert während FabF, GlmS und HemX reprimiert). Die Daten weisen darauf hin, dass TypA an der Adhärenz von EPEC beteiligt sind [257, 259]. Daher könnte die Repression von TypA durch Zink von Bedeutung für die Virulenz sein. Basierend auf diesen Ergebnissen nehmen wir an, dass der mögliche antibakterielle Effekt von Zink auf aEPEC durch die Kombination von mehreren physiologischen Mechanismen erreicht wird, wie zum Beispiel oxidativen Stress und metabolischen Einflüssen. Dies ist eine mögliche Erklärung für den in früheren Studien festgestellten Effekt, dass Zink die Virulenz von EPEC reduziert [158, 159]. Die durch Zink verursachte unterschiedliche Proteinexpression war besonders deutlich bei den E. coli- Stämmen des Wildtypes (kommensal und pathogen) in dieser Studie, sowohl als auch in dem vorher beschriebenen E. coli K-12. Das weist darauf hin, dass metabolische Strategien für die Adaptation bei Zinkstress zwischen den verschiedenen Stämmen variieren, möglicherweise durch die unterschiedliche Anzahl an Protein-kodierenden Genen, die in physiologischen Aktivitäten involviert sind.
