dc.contributor.author
Lu, Yun
dc.date.accessioned
2018-06-08T00:51:55Z
dc.date.available
2016-04-06T13:26:08.607Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/12583
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-16781
dc.description.abstract
Zinc is a micronutrient required for numerous cellular functions in all living
organisms. In recent years, zinc as an alternative additive is increasingly
used in farmed animals to enhance growth performance, as it is able to prevent
or reduce the duration and severity of diarrhea caused by some pathogens,
especially pathogenic E. coli. It has been reported that zinc supplementation
also leads to an increased rate of antibiotic resistance in commensal E. coli.
However, until now the underlying mechanisms of these effects driven by zinc
exposure have remained unclear. In our studies, we characterized two E. coli
strains, commensal strain IMT29408 and pathogenic strain IMT8073 (aEPEC)
defined by genotypic analysis, as representatives of porcine intestinal E.
coli to investigate zinc sensitivity, the effects of zinc on growth rates,
intracellular zinc content of commensal strain in vitro and protein expression
differences induced by zinc. Since there is only limited available knowledge
about laboratory strains (K-12) instead of wild-type strains that are highly
different in gene content and consequent physiological properties compared to
lab strains. In the present study, the bacteria were cultured in LB medium
using a bioreactor under anaerobic condition with or without 1 mM zinc
chloride determined on the basis of minimal inhibitory concentration test.
There were no significantly inhibitory influences of zinc on cell viability
represented by CFU per milliliter and cell turbidity represented by OD600
values from 1 h to 7 h in commensal strain IMT29408. By contrast, although the
cell viability of aEPEC IMT8073 was not significantly decreased by zinc, the
bacteria turbidities were reduced by zinc treatment from 1 h to 7 h. These
indicated that the inhibition of aEPEC virulence was likely not induced by the
reduction in bacterial viability, but rather by changes in cell physiology. In
the commensal strain IMT29408, we investigated how the intracellular zinc
content changes in the presence or absence of 1 mM zinc over time. The results
showed that from 0 h to 10 h of incubation, the intracellular zinc content was
about 8.6 x 10(6) atoms/cell in average with a maximum of 1.2 x 10(7)
atoms/cell at 2 h in the presence of zinc, while cultured in the control (LB
medium), the average value was about 1.1 x 10(5) atoms/cell with a peak amount
of 4.5 x 10(5) atoms/cell at 3 h. The results suggested that the intracellular
zinc content in commensal E. coli varies significantly with the changes in
environmental zinc availability and exposure time. Based on the growth rates
and intracellular zinc content curves over time, bacterial samples were
collected at 2 h and 5 h time points for proteomic analysis to investigate the
differences of protein expression between zinc treatment and control. In
commensal E. coli IMT29408, proteomic analysis using 2D-DIGE revealed 544
protein spots in total. We identified two differentially expressed (>1.5-fold
change, p<0.05 (student’s t test)) proteins up-regulated (DegP and FabF) and
seven proteins down-regulated (ManX, Mdh, Pgk, RbsB, RpoA, Tsf and YhdH) at 2
h of incubation with zinc using MALDI-TOF MS/MS. At 5 h of incubation, there
were seven up-regulated (DegP, FabF, RplD, TnaA, TpiA, Tsx and YchF) and three
down-regulated (AhpC, RffG and PflB) proteins identified. Most of them have
not previously been implicated in responding to zinc compared with the
available data about E. coli K-12, which are mainly involved in translation,
stress defense, glycolysis and transport. We also identified the
differentially expressed proteins only influenced by continuous zinc treatment
(from 2 h to 5 h), six up-regulated and fourteen down-regulated. Among these,
two porins OmpC and OmpX were down-regulated, which suggested that persistent
zinc treatment could result in reduced outer membrane permeability. These data
give evidence that reduced outer membrane permeability is a possible
explanation for the zinc-induced antibiotic resistance. In pathogenic E. coli
IMT8073, there were 413 protein spots detected by 2D-DIGE. Out of them, at 2 h
of incubation we identified two up-regulated proteins (KatE and ClpB), while
at 5 h, there were eleven up-regulated (AccC, AsnS, AspA, AtpA, AtpD, DegP,
FabF, HybC, PyrG, TnaA and Tsf) and six down-regulated (CadA, MinD, NanA,
NusA, PflB and Udp) proteins identified. From these identified proteins, we
concluded that pathogenic E. coli adapted to zinc stress by up-regulation of
proteins associated with oxidative stress defense, translation, and energy
generation (ATP synthesis, glycolysis, and anaerobic respiration) as a
survival strategy. We also identified eight up-regulated and twenty-six down-
regulated proteins only influenced by zinc when comparing 2 h to 5 h of
incubation. Most of these proteins were involved in translation (PrfB and LysS
up-regulated while Tuf, GlyS, TypA, RplI and GlnS down-regulated), metabolic
processes (GlpQ, GlnA and AspA up-regulated while FbaA, Pta, TdcE, PflB, MinD,
Gnd, CadA, PspE and EutD down-regulated) and biosynthetic processes (PdxJ up-
regulated while FabF, GlmS and HemX down-regulated). Of these proteins, TypA,
a regulatory protein was down-regulated and this suggested that persistent
zinc treatment probably influenced EPEC virulence, as typA-mutants of EPEC
showed declined adherence to cultured cells. Based on these results, it was
indicated that the antibacterial effects of zinc on EPEC are likely achieved
by a combination of multiple physiological mechanisms such as oxidative
stress, envelope stress and metabolic influences, which might be a possible
explanation for previous findings that zinc treatment reduces virulence of
EPEC. Comparatively, the differentially expressed proteins influenced by zinc
were mostly different among the wild-type E. coli strains (commensal and
pathogenic) in the present study as well as the E. coli K-12 described
previously. This indicated that the metabolic strategies for adaptation of
zinc stress vary among these strains, which is probably due to the different
number of protein-coding genes involved in physiological activities.
de
dc.description.abstract
Zink ist ein Spurenelement, das für zahlreiche zelluläre Funktionen in allen
lebenden Organismen benötigt wird. In den letzten Jahren nahm die Verwendung
von Zink als Alternative zu antibiotischen Leistungsfördereru als Futterzusatz
in der landwirtschaftlichen Tierhaltung zu, um vor allem das Wachstum der
Tiere zu fördern. Es wird außerdem angenommen, dass Durchfallerkrankungen, die
durch Pathogene und zwar speziell durch E. coli verursacht warden, durch die
Zugabe von Zink verhindert oder die Dauer und der schwere Verlauf abgemildert
werden können. Andererseits wurde berichtet, dass die Zugabe von Zink zu einem
höheren Auftreten von Antibiotikaresistenzen in kommensalen E. coli führt.
Bislang sind die dafür verantwortlichen Mechanismen unklar. In unseren
Untersuchungen haben wir zwei E. coli Stämme charakterisiert, den kommensalen
Stamm IMT29408 und den pathogenen Stamm IMT8073 (aEPEC), welche durch eine
genotypische Analyse definiert wurden. Die Stämme wurden repräsentativ für
porzine intestinale E. coli ausgewählt um die Zinksensivität, die Effekte von
Zink auf die E. coli Wachstumsrate, die intrazelluläre Zinkkonzentration und
die Unterschiede in der Proteinexpression, welche durch Zink induziert werden,
zu untersuchen. Bisherige Zink-abhängige Proteinexpressionsstudien
konzentrierten sich auf E. coli K-12 Laborstämme. Diese Stämme unterscheiden
sich jedoch enorm von Wildtyp-Stämmen - sowohl bezüglich Genomgröße als auch
der dadurch bedingten physiologischen Eigenschaften. Daher können die
bekannten K-12- abhängigen Ergebnisse nicht auf Wildtyp-Stämme übertragen
werden. In der aktuellen Studie wurden die E. coli Stämme in LB Medium
mit/ohne 1mM Zinkchlorid anaerob in einem Biorektor kultiviert. Die verwendete
Konzentration wurde mittels minimalen Hemmkonzentrationstests bestimmt. Es gab
keine signifikanten inhibitorischen Einflüsse von Zink auf die Zellvitalität
(KBE pro Milliliter) und Zelldichte (OD600nm Werte von 1-7 Stunden) im
kommensalen Stamm IMT29408. Die Zellvitalität des aEPEC Stamms wurde auch
nicht signifikant durch Zink beeinflusst. Jedoch war die Bakteriendichte
signifikant durch die Kultivierung mit Zink reduziert. Dies könnte darauf
hinweisen, dass die Virulenz von aEPEC weder durch die Reduktion der Vitalität
noch durch Veränderungen in der Zellmorphologie oder Physiologie inhibiert
wird. Die Untersuchung des intrazellulären Zinkgehalts in An- und Abwesenheit
von Zink im kommensalen Stamm IMT29408 ergab, dass während der Kultivierung
mit Zink der intrazelluläre Zinkgehalt durchschnittlich bei 8,6 x 10(6)
Atomen/Zelle lag. Er erreichte sein Maximum nach zwei Stunden mit 1,2 x 10(7)
Atomen/Zelle. Bei der Kultivierung ohne Zink im reinen LB-Medium lag der
Mittelwert bei 1,1 x 10(5) Atomen/Zelle mit einem Höchstwert von 4,5 x 10(5)
Atomen/Zelle. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die intrazelluläre
Zinkkonzentration in kommensalen E. coli signifikant mit den Veränderungen in
der Verfügbarkeit von Zink in der Umwelt und dem Zeitraum, dem es Zink
ausgesetzt ist, variiert. Basierend auf den zeitabhängigen Wachstumsraten und
der intrazellulären Zinkkonzentration wurden Proben nach 2 und 5 Stunden für
die Proteomanalyse gewonnen, um Unterschiede in der Proteinexpression zwischen
den Gruppen der Zinkbehandlung und Kontrolle zu messen. Die Proteomanalyse des
kommensalen E. coli IMT29408 mit 2D-DIGE und MALDI-TOF MS/MS zeigte 544
Proteinspots auf. Darunter konnten wir Proteine identifizieren, die
unterschiedlich exprimiert werden (>1.5-fold change, p<0.05 (student’s t
test)). Es gab zwei Proteine, die nach zwei Stunden induziert (DegP und FabF)
und sieben Proteine, die reprimiert waren (ManX, Mdh, Pgk, RbsB, RpoA, Tsf und
YhdH). Nach einer Inkubationszeit von fünf Stunden waren sieben Proteine
induziert (DegP, FabF, RplD, TnaA, TpiA, Tsx und YchF) und drei reprimiert
(AhpC, RffG und PflB). Die meisten dieser Proteine sind bislang nicht bekannt
dafür auf Zink zu reagieren, beruhend auf den Daten mit E. coli K-12. Die
genannten Proteine sind hauptsächlich involviert in der Translation, der
Stessantwort, der Glykolyse und dem Transport. Wir konnten ebenfalls Proteine
identifizieren, die nur durch Zink beeinflusst wurden (nach zwei und fünf
Stunden). Es waren sechs induzierte und 14 reprimierte Proteine. Unter diesen
waren auch die zwei Porine OmpC und OmpX reprimiert. Dies führt uns zu der
Annahme, dass eine andauernde Zinkbehandlung in einer reduzierten äußeren
Membranpermeabilität resultiert. Diese Daten könnten somit einen Hinweis für
einen möglichen Mechanismus für die zinkinduzierte Antibiotikaresistenz
liefern. Für den aEPEC Stamm IMT8073 konnten insgesamt 413 Proteinspots durch
die 2D-DIGE detektiert werden. Nach zwei Stunden Inkubation waren zwei
Proteine induziert (KatE und ClpB), während nach fünf Stunden elf Proteine
induziert (AccC, AsnS, AspA, AtpA, AtpD, DegP, FabF, HybC, PyrG, TnaA und Tsf)
und sechs reprimiert waren (CadA, MinD, NanA, NusA, PflB und Udp). Die
Identifizierung dieser Proteine lässt die Annahme zu, dass pathogene E. coli
sich an die hohe Zinkkonzentration adaptieren können durch Hochregulierung von
Proteinen, die mit oxidativer Stressantwort, Translation und Energiegeneration
(ATP Synthese, Glykolyse und anaerobische Atmung) assoziiert sind und dies als
eine Überlebensstrategie nutzen. Zudem wurden acht induzierte und 26
reprimierte Proteine durch den Einfluss von Zink identifiziert (nach zwei und
fünf Stunden Kultivierung mit Zink). Die meisten von diesen Proteinen sind in
der Translation (PrfB und LysS induziert während Tuf, GlyS, TypA, RplI und
GlnS reprimiert), metabolischen Prozessen (GlpQ, GlnA und AspA induziert
während FbaA, Pta, TdcE, PflB, MinD, Gnd, CadA, PspE und EutD reprimiert) und
biosynthetischen Prozessen involviert (PdxJ induziert während FabF, GlmS und
HemX reprimiert). Die Daten weisen darauf hin, dass TypA an der Adhärenz von
EPEC beteiligt sind [257, 259]. Daher könnte die Repression von TypA durch
Zink von Bedeutung für die Virulenz sein. Basierend auf diesen Ergebnissen
nehmen wir an, dass der mögliche antibakterielle Effekt von Zink auf aEPEC
durch die Kombination von mehreren physiologischen Mechanismen erreicht wird,
wie zum Beispiel oxidativen Stress und metabolischen Einflüssen. Dies ist eine
mögliche Erklärung für den in früheren Studien festgestellten Effekt, dass
Zink die Virulenz von EPEC reduziert [158, 159]. Die durch Zink verursachte
unterschiedliche Proteinexpression war besonders deutlich bei den E. coli-
Stämmen des Wildtypes (kommensal und pathogen) in dieser Studie, sowohl als
auch in dem vorher beschriebenen E. coli K-12. Das weist darauf hin, dass
metabolische Strategien für die Adaptation bei Zinkstress zwischen den
verschiedenen Stämmen variieren, möglicherweise durch die unterschiedliche
Anzahl an Protein-kodierenden Genen, die in physiologischen Aktivitäten
involviert sind.
de
dc.format.extent
VIII, 127 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Enteropathogenic Escherichia coli
dc.subject
culture techniques
dc.subject
growth inhibitors
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
Effects of zinc on protein expression of porcine commensal and pathogenic
Escherichia coli (E. coli)
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Lothar H.Wieler
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. Jürgen Zentek
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. Uwe Rösler
dc.date.accepted
2016-02-22
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000101657-6
dc.title.translated
Die Wirkung von Zink auf die Proteinexpression von porzinen kommensalen und
pathogenen Escherichia coli (E. coli)
de
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
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FUDISS_thesis_000000101657
refubium.note.author
Mensch und Buch Verlag
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FUDISS_derivate_000000018899
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