Advances in genomic technology have led to the identification of numerous genetic variants that are associated with specific phenotypes. Whole-exome sequencing is often applied to identify rare variants in the context of Mendelian disorders, whereas genome-wide association studies (GWAS) have identified thousands of common variants associated with specific, quantifiable human traits. In both instances, identifying the specific causal variant and subsequently determining its mechanism of action, even on a small scale, remains difficult. In this thesis, we took advantage of the recent identification of the first non-ribosomal protein gene mutation found in a family with Diamond-Blackfan anemia (DBA). We followed up on the molecular etiology of these patients and discovered new insights with respect to the pathophysiology of DBA. Furthermore, we functionally investigated the role of common genetic variation on red blood cell traits, leading to new biological insights of cell cycle regulators in terminal erythroid differentiation. In contrast to the more subtle effects in phenotype due to common genetic variation, rare genetic variants associated with Mendelian disorders are often deleterious and may require a significant amount of clinical attention. DBA is a rare congenital disease and is considered a disorder of the ribosome, as over 50 % of patients have heterozygous loss of function mutations in ribosomal protein genes, resulting in ribosomal haploinsufficiency. Although ribosomal proteins are ubiquitously expressed, the cell-type specific defect in the form of the anemia has puzzled researchers. Recently, in rare cases of DBA, mutations in the essential erythroid transcription factor GATA1 were described, but it remained unclear whether these patients shared a common pathophysiology as those with ribosomal haploinsufficiency. We show that ribosomal haploinsufficiency leads to impaired translation of GATA1 mRNA and connect these two seemingly disparate sets of molecular lesions. We suggest that the amount of functional ribosomes is depleted in DBA, decreasing the overall translation initiation capacity. This is supported by specific inhibition of translation initiation by the small molecule 4EGI-1, phenocopying many in vitro aspects of DBA. We attribute the apparent selective translational defect to a highly structured 5’ untranslated region of the GATA1 mRNA, restricting its efficient translation when the cellular translation initiation potential is impaired. Most importantly, analysis of transcriptional signatures of primary erythroid patient cells with ribosomal protein mutations supports impairment in GATA1 transcriptional activity in DBA, and ectopic GATA1 expression in these cells greatly improved impaired erythropoiesis. These findings have led to new insights into the pathophysiology of DBA and provide not only an explanation for the specificity of the observed defect but suggest potential therapeutic avenues such as GATA1 gene therapy approaches. More generally, this work implicates selectively impaired translation of specific transcripts as a mechanism of human disease. GWASs have been enormously successful at identifying genetic associations but usually provide limited immediate insight to the underlying biology of these associations. By following up on genetic variants associated with red blood cell count and the average volume of a red blood cell, we identified an unexpected role in terminal erythropoiesis for a common cell cycle regulator. The causal variant mapped to a transcription factor binding site bound by erythroid transcription factors. Reporter gene assays showed differential enhancer activity for the associated alleles, suggesting altered transcriptional regulation of the nearby gene, cyclin D3. By following up on cyclin D3, a detailed analysis showed that downregulation of cyclin D3 levels lead to premature cell cycle arrest, without ostensible defects in differentiation. As a result, erythroid progenitor cells underwent fewer cell divisions and remained larger in size, preserving overall hemoglobin levels. Collectively, these data suggest that varying levels of cyclin D3 in terminal erythropoiesis contribute to the natural variation observed in red blood cell parameters in the human population. Together, both studies illustrate how the functional follow up of rare and common human genetic variation leads to new insights and a deeper understanding of the underlying biology that effect basic cellular processes such as cell cycle regulation and translation in physiology and disease.
Die Fortschritte in Genotypisierungs- und Sequenzierungstechnologien haben zur Entdeckung von zahlreichen humanen genetischen Varianten geführt, welche mit spezifischen Phänotypen bzw. Pathologien assoziiert sind. Die Exomsequenzierung wird häufig für die Identifizierung von seltenen genetischen Varianten in monogenetischen Erkrankungen genutzt. Im Gegensatz dazu haben genomweite Assoziationsstudien (GWAS) tausende von häufigen genetischen Varianten entdeckt, welche mit spezifischen humanen Phänotypen und Merkmalen assoziiert sind. Üblicherweise stellt in beiden Fällen die Identifizierung der kausalen Variante und die anschließende Aufklärung der damit verbundenen mechanistischen Grundlagen eine große Hürde dar. In der vorgelegten Dissertation haben wir auf Basis der jüngsten Entdeckung der ersten nicht- ribosomalen Mutation in einer Familie mit Diamond-Blackfan Anämie (DBA) den zu Grunde liegenden molekularen Mechanismus untersucht und neue Erkenntnisse über die damit verbundene Pathophysiologie dieser Erkrankung gewonnen. Darüber hinaus haben wir die Rolle von häufigen genetischen Varianten mit Assoziationen zu humanen Erythrozyten-Merkmalen untersucht und konnten so eine neue und ungeahnte Rolle für Zellzyklus-Regulatoren in der terminalen erythropoetischen Differenzierung aufdecken. Häufige genetische Varianten haben in der Regel eine geringen Einfluss auf die Ausprägung eines (Krankheits-)Merkmals, wohingegen monogenetische Erkrankungen oft mit starker Beeinträchtigung sowie intensiver klinischer Betreuung einhergehen. DBA ist ein seltenes kongenitales Syndrom und ist assoziiert mit einer Funktionsstörung des Ribosoms. Über 50 % der Patienten haben heterozygote Funktionsverlustmutationen in Genen ribosomaler Proteine, die zu ribosomaler Haploinsuffizienz führen. Obwohl ribosomale Proteine ubiquitär exprimiert werden, stellte der zelltyp-spezifische Defekt in Form der Anämie Wissenschaftler lange Zeit vor ein Rätsel. Vor kurzem wurden in seltenen Fällen von DBA Mutationen im Gen des für die Erythropoese essentiellen Transkriptionsfaktors GATA1 beschrieben. Es blieb jedoch zunächst unklar, ob diesen Patienten, sowie Patienten mit ribosomaler Haploinsuffizienz eine gemeinsame Pathophysiologie zugrunde liegt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass ribosomale Haploinsuffizienz die Translation von GATA1 mRNA beeinträchtigt und somit eine Verbindung zwischen den beiden scheinbar ungleichen molekularen Läsionen herstellt. Wir gehen davon aus, dass in DBA die Anzahl funktioneller Ribosomen reduziert und somit auch das Translationsinitiations-Potential der Zelle verringert ist. Diese Annahme wird durch die Beobachtung gestützt, dass die spezifische Inhibition der Translationinitiation mit dem Molekül 4-EGI1 viele in vitro Charakteristika von DBA nachbildet. Wir konnten die scheinbar selektiv beeinträchtigte Translation auf eine ausgeprägt strukturierte 5’ untranslatierte Region von GATA1 mRNA zurückführen, welche ihre effiziente Translation unter Bedingungen reduzierter Translationsinitiations-Kapazität der Zelle einschränkt. Die Bedeutung von GATA1 in DBA wird durch eine signifikante Verminderung der transkriptionellen Aktivität von GATA1 in primären Zellen von DBA Patienten mit Mutationen in ribosomalen Proteinen untermauert. Entsprechend konnte die ektope Expression von GATA1 in diesen Zellen die beeinträchtigte Erythropoese stark verbessern. Diese Beobachtungen haben neue Einblicke in die Pathophysiologie von DBA geschaffen und erklären nicht nur die Spezifizität des Defekts, sondern bereiten auch den Weg für neue therapeutische Ansätze wie die Gentherapie mittels GATA1. Ferner legen unsere Erkenntnisse die selektiv beeinträchtigte Translation spezifischer Transkripte als Grundlage für eine humane Pathologie dar. GWAS haben eine Vielzahl neuer genetischer Assoziationen entdeckt, liefern unmittelbar jedoch nur geringe Erkenntnisse über die zugrunde liegende Biologie dieser Assoziationen. Durch Untersuchung von genetischen Varianten, welche mit Erythrozyten-Merkmalen wie der Anzahl und dem durchschnittlichen Volumen von roten Blutkörperchen assoziiert sind, haben wir Zellzyklus-Regulatoren eine bisher unbekannte Rolle zugeordnet. Die kausale Variante konnte in einer Bindungsstelle von erythropoetischen Transkriptionsfaktoren lokalisiert werden. Reportergen-Analysen zeigten unterschiedliche Enhancer-Aktivität für die assoziierten Allele und lassen variierende Mengen an Transkripten als Ursache für die Beeinflussung von Erythrozyten-Merkmalen vermuten. Wir identifizierten das durch die kausale Variante regulierte Gen Cyclin D3, und zeigen, dass geringere Cyclin D3-Level zu einem frühzeitigen Stopp des Zellzyklus führen, ohne die Differenzierung wesentlich zu beeinflussen. Das führt dazu, dass sich erythropoetischen Vorläuferzellen seltener teilen und sich so größere Erythrozyten bilden, welche somit den Hämoglobinspiegel aufrecht erhalten. Allgemein tragen so unterschiedliche Mengen an Cyclin D3 in der terminalen Erythropoese zu der natürlich vorkommenden Variation in Erythrozyten-Merkmalen in der menschlichen Bevölkerung bei. Zusammen illustrieren beide Studien, wie die funktionelle Untersuchung von seltenen und häufigen genetischen Varianten tiefere Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen liefern, welche fundamentale zelluläre Prozesse wie die Zellzyklus-Regulation und Translation in Physiologie und Krankheit beeinflussen.
