dc.contributor.author
Sutherland, Mark
dc.date.accessioned
2018-06-08T00:20:36Z
dc.date.available
2002-02-27T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11800
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-15998
dc.description
Überschrift 1 : Times New Roman 14 INDEX
Start
Acknowledgements i
Summary ii
Index iv
List of figures viii
List of tables ix
Abbreviations x
Chapter 1 Introduction
1.1 The arachidonic acid cascade 1
1.2 The lipoxygenases 2
1.2.1 Classification of the Lipoxygenases 2
1.3 The 12-Lipoxygenase Pathway 5
1.3.1 Heterogeneity of the 12-Lipoxygenases 5
1.3.2 Platelet-type vs. Leukocyte-type 12-Lipoxygenase 7 1.3.2.1 Primary
structure and multifunctional catalysis 7
1.3.2.2 Substrate Specificity 8
1.3.2.3 Suicide Inactivation 8 1.3.3 The Bifurcated Nature of the 12-LOX
pathway 9
1.4 Role of oxidative stress and the hydroperoxide tone in eicosanoid
metabolism 9
1.5 Heterogeneity of 12-HpETE reducing enzymes 11
1.5.1 The Selenium-dependent peroxidases 12 1.5.1.1 Localisation and
structure 12
1.5.1.2 Role of the selenium status 13
1.5.1.3 Role of GPx-1 13
1.5.1.4 Role of PHGPx 14 1.5.2 The Selenium-independent enzymes 14
1.6 Regulation of the 12-LOX pathway by seleno-enzymes 15
1.6.1 Effect of selenium deficiency on the 12-LOX pathway 15
1.6.2 PHGPx as an inhibitor of lipoxygenases 16
1.7 Heterogeneity of catalysts involved in hepoxilin synthesis 17
1.8 Biological role of 12-LOX derived eicosanoids 18
1.8.1 Biological role of 12-HpETE and 12-HETE 18
1.8.2 Biological Role of HXA3 19
1.9 Role of hepoxilin in disease 21
1.10 Objectives 23
Chapter 2 Materials and Methods
2.1 Materials 25
2.2 Methods 26
2.2.1 Cell preparation and pretreatments 26
2.2.2 Cell lines and culturing 26
2.2.3 Preparation of
1-Palmitoyl-2-[(15S)-hydroperoxy-(5Z,8Z,11Z,13E)-eicosatetraenoyl]-phosphatidylcholine
(PAPC-OOH) 27
2.2.4 Assay of enzymatic activity 27
2.2.5 Rate of breakdown of PHGPx mRNA in UT-7 cells 27
2.2.6 AA metabolism in platelets, A431 and UT-7 cells. 28
2.2.7 HXA3 formation by mammalian 12-Lipoxygenases 28
2.2.8 GC-MS analysis of eicosanoids 29
2.2.9 HPLC analysis of eicosanoids 29
2.2.10 Detection of PHGPx and 12-LOX by Reverse Transcription-PCR 29
2.2.11 Quantification of PHGPx expression 30
2.2.12 Measurement of chemotaxis 30
2.2.13 Arachidonic acid release 30
2.2.14 LTB4 release 31
2.2.15 Cyclic-adenosine monophosphate (cAMP) release 31
2.2.16 Intracellular Ca2+ measurement 31
2.2.17 PMN aggregation 32
2.2.18 Phospholipid remodelling 32
2.2.19 Cell proliferation 32
2.2.20 Superoxide anion generation 33
2.2.21 Measurement of oxygen uptake 33
2.2.22 Western blotting 33
Chapter 3 Results
I 12-Lipoxygenase pathway in platelets and other cells
3.1 Detection of PHGPx and determination of its activity 34
3.1.1 Detection by Western Blotting 34
3.1.2 Detection by PCR 35
> > 3.1.2.1 Occurrence of short-lived PHGPx mRNA in human megakaryocytes 36
3.1.3 PHGPx and GPx-1 activity in human platelets 36
3.2 Measurement of arachidonic acid and the 12-LOX metabolites 12-HpETE,
12-HETE and hepoxilins
3.2.1 Optimisation of the extraction 39
3.2.2 Identification of the end products by HPLC and quantification 40
3.2.3 Identification of the end products by GC-MS and quantification 42
3.3 Regulatory role of selenoenzymes on the 12-LOX pathway 43
3.3.1 Both GPx-1 and PHGPx reduce 12-HpETE in vitro 43
3.3.2 Role of selenoenzymes in regulating the 12-LOX pathway in vivo 45
3.3.3 Distinct roles for GPx-1 and PHGPx on 12-HpETE reduction 47
3.4 Hepoxilin formation in human platelets 49
3.4.1 Hepoxilin formation with arachidonic acid as substrate 49
> > 3.4.1.1 Identification of two isomers of trioxilin A3 :-8,11,12-TriHETrE
and 8,9,12-TriHETrE 51
3.4.2 Hepoxilin formation from 12-HpETE 52
3.5 Hepoxilin formation in other cell systems 54
3.5.1 The megakaryoblast cell line UT-7 54
3.5.2 The epidermoid tumour cell line A431 56 3.5.2.1 Hepoxilin formation
from arachidonic acid 56
3.5.2.2 Hepoxilin formation from 12-HpETE 57 3.6 Hepoxilin formation by
platelet- and leukocyte type 12-LOX 58
3.6.1 Oxygen uptake by mammalian lipoxygenases 58
3.6.2 Hepoxilin formation by the mammalian lipoxygenases 59
3.6.3 Effect of inactivation of mammalian lipoxygenases on hepoxilin formation
60
3.7 Biological effects of HXA3 on tumour cells 61
3.7.1 Effect of Eicosanoids on PHGPx mRNA Transcription 61
> > 3.7.1.1 Dose-dependent effect of HXA3 on PHGPx mRNA transcription 62
> 3.7.1.2 Time Course of PHGPx mRNA Induction 63
3.7.2 Effect of HXA3 on Cell Proliferation 64
II Biological actions of HXA3 on human neutrophils
3.8 Chemotactic activity of HXA3 67
3.9 Calcium release 67
3.10 Aggregatory activity of HXA3 68
3.11 cAMP release 70
3.12 Arachidonic acid release and leukotriene B4 formation 71
3.13 Respiratory burst 74
3.14 Regulatory volume decrease 74
Chapter 4 Discussion
4.1 Evidence for the activity and occurrence of PHGPx in human platelets 76
4.2 Role of the glutathione peroxidases in regulating HXA3 synthesis in human
platelets 77
4.3 Distinct roles of the glutathione peroxidases in regulating HXA3 synthesis
in other cell types 80
4.4 Role of mammalian lipoxygenases in HXA3 synthesis 81
4.5 Regulation of PHGPx mRNA transcription by eicosanoids 82
4.6 Biological actions of HXA3 on human neutrophils 83
Chapter 5 Conclusion
Chapter 6 References
PUBLICATIONS \- POSTERS - CURRICULUM VITAE
dc.description.abstract
Abstract
The biosynthesis of hepoxilins in human platelets, the epidermoid carcinoma
cell line A431 and the megakaryoblast cell line UT-7 was investigated. To
determine which enzymes play a role in regulating the 12-lipoxygenase pathway,
and thus hepoxilin synthesis, the roles of the selenoenzymes cytosolic
glutathione peroxidase (GPx-1) and phospholipid hydroperoxide glutathione
peroxidase (PHGPx) were examined. This study presents for the first time the
presence of PHGPx protein, a membrane bound protein, and its activity in human
platelets. The presence of PHGPx protein was revealed using two different
antibodies that exhibited a positive reaction corresponding to the expected
molecular weight of PHGPx in both human platelets and A431 cells. The activity
of PHGPx was determined using the PHGPx-specific substrate
1-palmitoyl-2-[(15S)-hydroperoxy-(5Z,8Z,11Z,13E)-eicosatetraenoyl
]-phosphatidyl-choline. RT-PCR failed to detect PHGPx mRNA in human platelets
which was, however, detected in megakaryocytes. Analysis of mRNA beakdown
rates in differentiated UT-7 cells revealed a short half-life for PHGPx mRNA
as compared to 12-LOX mRNA. Both GPx-1 and PHGPx, seperated on a Sephadex
G-100 (SF) column, exhibited 12-HpETE reductase activity. The ratio of
GPx-1:PHGPx activity using 12-HpETE as substrate was found to be approximately
60:1 in human platelets, in megakaryoblasts UT-7 and in epidermoid cell line
A431. Hepoxilin formation was not observed in the three cell types when
arachidonic acid (100 m M) was used as substrate. In the presence of the
selenoenzyme inhibitor iodoacetate, which inhibits both PHGPx and GPx-1, an
~80% inhibition of 12-HETE formation together with a concomitant increase of
12-HpETE by two orders of magnitude was observed. This was accompanied by the
formation of hepoxilin A3 and B3. Both HXA3 and HXB3 were detected, in the
absence of iodoacetate, when 12-HpETE was used as substrate. Selenium
deficient UT-7 cells, which exhibited PHGPx activity but no measurable GPx-1
activity, reduced 12-HpETE, albeit at a slower rate as compared to wild-type
cells. A 10-fold increase in HXA3 formation was observed in UT-7 cells in the
presence of iodoacetate. It is therefore proposed that both GPx-1 and PHGPx
are involved in regulating the 12-LOX pathway in platelets and other cells by
reducing the hydroperoxide tone and diverting the isomerisation route to the
reduction route, thus controlling hepoxilin biosynthesis. Moreover, hepoxilin
A3 was found to up-regulate the expression of PHGPx mRNA in both A431 and HeLa
cells, suggesting that HXA3 may function as a stress-induced protective
eicosanoid.
In earlier reports and reviews, it was reported that the free acid form of
hepoxilin A3, unlike its methyl ester, does not enter neutrophils and other
cells. We report in the present study that the free acid of HXA3 is capable of
stimulating intact cells. Various experiments were performed to determine its
biological activity. Thus, hepoxilin A3 was found to induce chemotaxis at
concentrations as low as 30-40 nM. At concentrations around 1 µM, HXA3 gave
rise to an instantaneous release of intracellular calcium that caused a slight
liberation of arachidonic acid. Pretreatment of neutrophils with submicromolar
concentrations of HXA3 significantly blunted fMLP-induced arachidonic acid
release and resulted in a 2-3 fold increase in fMLP-induced cAMP release.
However, HXA3 did not induce respiratory burst, oxygen uptake or aggregation.
The free acid was found to induce A431 and HeLa cell proliferation as
determined by thymidine incorporation assays. The present study thus provides
ample evidence that HXA3 is biologically active towards cells in its
unesterified form.
de
dc.description.abstract
Zusammenfassung
Die Biosynthese von Hepoxilinen wurde in humanen Thrombozyten, der
epidermoiden Krebszellinie A431 und der Megakaryoblasten Zellinie UT-7
untersucht. Um die Enzyme, die eine Rolle in der Regulation des 12
-Lipoxygenase-Signalweges in der Hepoxilin Synthese spielen, zu identifizieren
wurden die Selenoenzyme Zytosolische-Glutathionperoxidase (GPx-1) und
Phospholipid-Hydroperoxid-Glutathionperoxidase (PHGPx) untersucht. Es konnte
zum ersten Mal gezeigt werden, dass PHGPx, ein membranständiges Protein, in
humanen Thrombozyten vorhanden und dort aktiv ist. Diese Lokalisierung konnte
durch zwei Antikörper nachgewiesen werden, die eine Bande mit erwartetem
Molekulargewicht in humanen Thrombozyten und A431 Zellen detektierten. Die
Aktivität der PHGPx konnte mittels des PHGPx-spezifischen Substrats
1-Palmitoyl-2-[(15S)-hydroperoxy-(5Z, 8Z, 11Z,
13E)-eicosatetraenoyl]-phosphatidylcholin nachgewiesen werden. Mittels RT-PCR
konnte keine PHGPx mRNA in humanen Thrombozyten nachgewiesen werden, wohl aber
in Megakaryozyten. Bestimmung der mRNA Abbaugeschwindigkeit in differentierten
UT-7 Zellen zeigte eine kurze Halbwertszeit für PHGPx mRNA verglichen mit
12-LOX mRNA. Nach Trennung von GPx-1 und PHGPx mittels Sephadex G-100
Chromatographie konnte für beide Enzyme eine 12-HpETE Reduktaseaktivität
nachgewiesen werden. Das Verhältnis von GPx-1-zu PHGPx-Aktivität bezüglich des
Substrates 12-HpETE beträgt ungefähr 60:1 in humanen Thrombozyten, in UT-7 und
A421 Zellen. In allen Zelltypen wurde keine Synthese von Hepoxilin gefunden,
wenn Arachidonsäure als Substrat eingesetzt wurde. In Anwesenheit des
Selenoenzym-Inhibitors Iodoacetat, welcher PHGPx und GPx-1 inhibiert, konnte
~80% Inhibierung bezüglich 12-HETE Bildung festgestellt werden, während der 12
-HpETE-Wert um das 100fache anstieg. Gleichzeitig wurden die erhöhte synthese
von Hepoxilin A3 und B3 festgestellt. Diese wurden ebenfalls in Abwesenheit
von Iodoacetat, wenn 12-HpETE als Substrat verwendet wurde detektiert.
Selendefiziente UT-7 Zellen, die PHGPx Aktivität besitzen, aber keine messbare
GPx-1 Aktivität aufweisen, reduzierten 12-HpETE, wenn auch langsamer als
Wildtypzellen. Ein zehnfacher Anstieg an HXA3 wurde in UT-7 Zellen in
Anwesenheit von Iodoacetat beobachtet. Es wird postuliert, dass GPx-1 und
PHGPx an der Regulation des 12-LOX Signalweges in Thrombozyten und anderen
Zellen beteiligt sind, indem sie den Hydroperoxidton herabsetzen und den
Isomerisierungsweg zum Reduktionsweg umleiten, und somit die
Hepoxilinbiosynthese steuern. Weiterhin wurde gefunden, dass Hepoxilin A3 die
Expression von PHGPx mRNA in A431 und HeLa Zellen hochreguliert, was darauf
hinweist, dass das Eicosanoid HXA3 die Zellen gegen den oxidativen Stress
schützt.
In früheren Veröffentlichungen wurde berichtet, dass die freie Säure von
Hepoxilin A3 nicht membrangängig ist, und deshalb im Gegensatz zum
Methylierten HXA3 keine Wirkung auf Neutrophilen und anderen Zellen ausüben
kann. In dieser Arbeit wird berichtet, dass die freie Säure von HXA3 intakte
Zellen wohl stimulieren kann. Verschiedene Experimente belegen ihre
biologische Aktivität. So wurde festgestellt, dass Hepoxilin A3 Chemotaxis
schon bei Konzentrationen von 30 bis 40 nM induziert. Bei Konzentrationen um 1
µM fand eine sofortige Freisetzung von intrazellulärem Calcium statt, welche
zu einer geringfügigen Freisetzung von Arachidonsäure führt. Behandlung von
Neutrophilen mit Konzentrationen von weniger als ein µmolar inhibierte fMLP-
induzierte Freisetzung von Arachidonsäure, und zu einem zwei bis dreifachen
Anstieg von fMLP-induzierter cAMP-Freisetzung führte. Jedoch wurde keine
Induktion der "oxidative burst", der O2-Aufnahme oder der Neutrophilen-
Aggregation durch HXA3 beobachtet. Mittels "thymidine incorporation assay "
konnte gezeigt werden, dass die freie Säure eine Proliferation bei A431 und
HeLa Zellen induziert. Damit belegt die vorliegende Arbeit in einer Reihe von
Versuchen, dass HXA3 in der nicht veresterten Form in verschiedenen Zelltypen
biologisch aktiv ist.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Glutathione peroxidase 12-lipoxygenase Hepoxilin platelets
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Role of Phospholipid Hydroperoxide Glutathione Peroxidase in Hepoxilin A3
Biosynthesis in Human Platelets and Biological Actions of Hepoxilin A3 on
Human Neutrophils
dc.contributor.firstReferee
Dr. Dr. Dr. Santosh Nigam
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Dr. Christoph C. Geilen
dc.date.accepted
2002-02-12
dc.date.embargoEnd
2002-04-10
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2002000274
dc.title.translated
Bedeutung der Phospholipidhydroperoxid-Glutathionperoxidase für die Biosythese
von Hepoxilin A3 in humanen Thrombozyten und biologische Wirkungen von
Hepoxilin A3 auf humane Neutrophile
de
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
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FUDISS_thesis_000000000598
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2002/27/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000000598
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