Abstract
The biosynthesis of hepoxilins in human platelets, the epidermoid carcinoma cell line A431 and the megakaryoblast cell line UT-7 was investigated. To determine which enzymes play a role in regulating the 12-lipoxygenase pathway, and thus hepoxilin synthesis, the roles of the selenoenzymes cytosolic glutathione peroxidase (GPx-1) and phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx) were examined. This study presents for the first time the presence of PHGPx protein, a membrane bound protein, and its activity in human platelets. The presence of PHGPx protein was revealed using two different antibodies that exhibited a positive reaction corresponding to the expected molecular weight of PHGPx in both human platelets and A431 cells. The activity of PHGPx was determined using the PHGPx-specific substrate 1-palmitoyl-2-[(15S)-hydroperoxy-(5Z,8Z,11Z,13E)-eicosatetraenoyl ]-phosphatidyl-choline. RT-PCR failed to detect PHGPx mRNA in human platelets which was, however, detected in megakaryocytes. Analysis of mRNA beakdown rates in differentiated UT-7 cells revealed a short half-life for PHGPx mRNA as compared to 12-LOX mRNA. Both GPx-1 and PHGPx, seperated on a Sephadex G-100 (SF) column, exhibited 12-HpETE reductase activity. The ratio of GPx-1:PHGPx activity using 12-HpETE as substrate was found to be approximately 60:1 in human platelets, in megakaryoblasts UT-7 and in epidermoid cell line A431. Hepoxilin formation was not observed in the three cell types when arachidonic acid (100 m M) was used as substrate. In the presence of the selenoenzyme inhibitor iodoacetate, which inhibits both PHGPx and GPx-1, an ~80% inhibition of 12-HETE formation together with a concomitant increase of 12-HpETE by two orders of magnitude was observed. This was accompanied by the formation of hepoxilin A3 and B3. Both HXA3 and HXB3 were detected, in the absence of iodoacetate, when 12-HpETE was used as substrate. Selenium deficient UT-7 cells, which exhibited PHGPx activity but no measurable GPx-1 activity, reduced 12-HpETE, albeit at a slower rate as compared to wild-type cells. A 10-fold increase in HXA3 formation was observed in UT-7 cells in the presence of iodoacetate. It is therefore proposed that both GPx-1 and PHGPx are involved in regulating the 12-LOX pathway in platelets and other cells by reducing the hydroperoxide tone and diverting the isomerisation route to the reduction route, thus controlling hepoxilin biosynthesis. Moreover, hepoxilin A3 was found to up-regulate the expression of PHGPx mRNA in both A431 and HeLa cells, suggesting that HXA3 may function as a stress-induced protective eicosanoid.
In earlier reports and reviews, it was reported that the free acid form of hepoxilin A3, unlike its methyl ester, does not enter neutrophils and other cells. We report in the present study that the free acid of HXA3 is capable of stimulating intact cells. Various experiments were performed to determine its biological activity. Thus, hepoxilin A3 was found to induce chemotaxis at concentrations as low as 30-40 nM. At concentrations around 1 µM, HXA3 gave rise to an instantaneous release of intracellular calcium that caused a slight liberation of arachidonic acid. Pretreatment of neutrophils with submicromolar concentrations of HXA3 significantly blunted fMLP-induced arachidonic acid release and resulted in a 2-3 fold increase in fMLP-induced cAMP release. However, HXA3 did not induce respiratory burst, oxygen uptake or aggregation. The free acid was found to induce A431 and HeLa cell proliferation as determined by thymidine incorporation assays. The present study thus provides ample evidence that HXA3 is biologically active towards cells in its unesterified form.
Zusammenfassung
Die Biosynthese von Hepoxilinen wurde in humanen Thrombozyten, der epidermoiden Krebszellinie A431 und der Megakaryoblasten Zellinie UT-7 untersucht. Um die Enzyme, die eine Rolle in der Regulation des 12 -Lipoxygenase-Signalweges in der Hepoxilin Synthese spielen, zu identifizieren wurden die Selenoenzyme Zytosolische-Glutathionperoxidase (GPx-1) und Phospholipid-Hydroperoxid-Glutathionperoxidase (PHGPx) untersucht. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass PHGPx, ein membranständiges Protein, in humanen Thrombozyten vorhanden und dort aktiv ist. Diese Lokalisierung konnte durch zwei Antikörper nachgewiesen werden, die eine Bande mit erwartetem Molekulargewicht in humanen Thrombozyten und A431 Zellen detektierten. Die Aktivität der PHGPx konnte mittels des PHGPx-spezifischen Substrats 1-Palmitoyl-2-[(15S)-hydroperoxy-(5Z, 8Z, 11Z, 13E)-eicosatetraenoyl]-phosphatidylcholin nachgewiesen werden. Mittels RT-PCR konnte keine PHGPx mRNA in humanen Thrombozyten nachgewiesen werden, wohl aber in Megakaryozyten. Bestimmung der mRNA Abbaugeschwindigkeit in differentierten UT-7 Zellen zeigte eine kurze Halbwertszeit für PHGPx mRNA verglichen mit 12-LOX mRNA. Nach Trennung von GPx-1 und PHGPx mittels Sephadex G-100 Chromatographie konnte für beide Enzyme eine 12-HpETE Reduktaseaktivität nachgewiesen werden. Das Verhältnis von GPx-1-zu PHGPx-Aktivität bezüglich des Substrates 12-HpETE beträgt ungefähr 60:1 in humanen Thrombozyten, in UT-7 und A421 Zellen. In allen Zelltypen wurde keine Synthese von Hepoxilin gefunden, wenn Arachidonsäure als Substrat eingesetzt wurde. In Anwesenheit des Selenoenzym-Inhibitors Iodoacetat, welcher PHGPx und GPx-1 inhibiert, konnte ~80% Inhibierung bezüglich 12-HETE Bildung festgestellt werden, während der 12 -HpETE-Wert um das 100fache anstieg. Gleichzeitig wurden die erhöhte synthese von Hepoxilin A3 und B3 festgestellt. Diese wurden ebenfalls in Abwesenheit von Iodoacetat, wenn 12-HpETE als Substrat verwendet wurde detektiert. Selendefiziente UT-7 Zellen, die PHGPx Aktivität besitzen, aber keine messbare GPx-1 Aktivität aufweisen, reduzierten 12-HpETE, wenn auch langsamer als Wildtypzellen. Ein zehnfacher Anstieg an HXA3 wurde in UT-7 Zellen in Anwesenheit von Iodoacetat beobachtet. Es wird postuliert, dass GPx-1 und PHGPx an der Regulation des 12-LOX Signalweges in Thrombozyten und anderen Zellen beteiligt sind, indem sie den Hydroperoxidton herabsetzen und den Isomerisierungsweg zum Reduktionsweg umleiten, und somit die Hepoxilinbiosynthese steuern. Weiterhin wurde gefunden, dass Hepoxilin A3 die Expression von PHGPx mRNA in A431 und HeLa Zellen hochreguliert, was darauf hinweist, dass das Eicosanoid HXA3 die Zellen gegen den oxidativen Stress schützt.
In früheren Veröffentlichungen wurde berichtet, dass die freie Säure von Hepoxilin A3 nicht membrangängig ist, und deshalb im Gegensatz zum Methylierten HXA3 keine Wirkung auf Neutrophilen und anderen Zellen ausüben kann. In dieser Arbeit wird berichtet, dass die freie Säure von HXA3 intakte Zellen wohl stimulieren kann. Verschiedene Experimente belegen ihre biologische Aktivität. So wurde festgestellt, dass Hepoxilin A3 Chemotaxis schon bei Konzentrationen von 30 bis 40 nM induziert. Bei Konzentrationen um 1 µM fand eine sofortige Freisetzung von intrazellulärem Calcium statt, welche zu einer geringfügigen Freisetzung von Arachidonsäure führt. Behandlung von Neutrophilen mit Konzentrationen von weniger als ein µmolar inhibierte fMLP- induzierte Freisetzung von Arachidonsäure, und zu einem zwei bis dreifachen Anstieg von fMLP-induzierter cAMP-Freisetzung führte. Jedoch wurde keine Induktion der "oxidative burst", der O2-Aufnahme oder der Neutrophilen- Aggregation durch HXA3 beobachtet. Mittels "thymidine incorporation assay " konnte gezeigt werden, dass die freie Säure eine Proliferation bei A431 und HeLa Zellen induziert. Damit belegt die vorliegende Arbeit in einer Reihe von Versuchen, dass HXA3 in der nicht veresterten Form in verschiedenen Zelltypen biologisch aktiv ist.
