Die Bedeutung der zweiten extrazellulären Schleife von Claudin-3 und Claudin-5 für Claudin-Interaktionen und Tight junction-Strangbildung

Abstract

Epithelien und Endothelien bilden in multizellulären Organismen Barrieren, die für die Funktion dieser Organe essentiell sind, jedoch die Wirkstoffpermeation einschränken können. Um die freie Diffusion wasserlöslicher Moleküle durch die Zwischenräume von Epithel- und Endothelzellen zu begrenzen, ist der parazelluläre Spalt zwischen diesen Zellen durch Tight junctions (TJ) abgedichtet. TJs erscheinen in der Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie als intramembranöse Netzwerke aus Strängen im apikalen Bereich der lateralen Plasmamembran. Strukturelles Rückgrat der TJs der besonders dichten Blut- Hirnschranke sind die Claudine (Cld) 3 und 5. Cld5 dichtet die TJs der Blut- Hirnschranke für Moleküle kleiner als 800 Da ab. Hypothese dieser Arbeit ist, dass die Strangbildung und der Verschluss des parazellulären Spalts auf homo- und heterophile cis\- und trans-Interaktionen der Claudine zurückzuführen ist, deren molekularer Interaktionsmechanismus bisher ungeklärt gewesen ist.

Mit dieser Arbeit wurde eine direkte homophile Selbstassoziation der zweiten extrazellulären Schleife (2.EZS) der Claudine 3 und 5 mit Größenausschlusschromatographie nachgewiesen. Eine Beteiligung der 2.EZS an der trans-Interaktion, nicht jedoch an der cis-Interaktion, wurde durch systematische Aminosäuresubstitutionen der 2.EZS von Cld5 bewiesen. Zudem wurden molekulare Determinanten identifiziert, die in die trans-Interaktion involviert sind. Dazu wurden TJ-lose HEK-293-Zellen verwendet, in denen die homophile cis\- und trans-Interaktion sowie die Strangbildung von Cld5 frei vom Einfluss endogener Claudine untersucht wurde. Die Analyse der trans- Interaktionsfähigkeit mittels konfokaler Mikroskopie sowie die Ermittlung der subzellulären Lokalisation der Cld-Mutanten durch Zelloberflächen- Biotinylierung und konfokale Mikroskopie führten zu strukturellen Modellen eines Cld5-Monomers und eines Cld5-trans-Dimers. Dazu wurde auf die 2.EZS von Cld5 die sequenzhomologe Teilstruktur eines hypothetischen, bakteriellen Proteins (BB2244) übertragen. Die 2.EZS von Cld5 ist demnach eine Helix-turn- Helix-Struktur, deren turn-Konformation durch ein Netzwerk aus Wasserstoffbrücken, die Proline P150 und P153 sowie durch hydrophobe Seitenketteninteraktionen zwischen V152 und L160 stabilisiert wird. Nach dem Dimer-Modell trans-dimerisiert die 2.EZS durch eine Wechselwirkung von drei aromatischen Seitenketten (F147, Y148, Y158) zweier Schleifen miteinander. Eine potentielle Bindungsstelle der ebenfalls an der trans-Interaktion beteiligten Aminosäuren Q156 und E159 konnten bisher nicht identifiziert werden. Die Strukturmodelle lassen sich auf Claudine mit hoher Sequenzhomologie übertragen, die dadurch erstmals als klassische Claudine 1-10, 14, 15, 17 und 19 definiert werden.

Weiterhin wurde das Zusammenspiel von Claudinen bei der Strangbildung hinsichtlich cis\- und trans-Interaktionen untersucht. Mutanten mit gestörter trans-Interaktion zeigten in der Gefrierbruch-Elektronenmikrospkopie eine stark verringerte Zahl intramembranöser Stränge, obwohl die cis-Interaktion unbeeinträchtigt blieb. Es wird ein Schema postuliert, das die Morphologie von Claudin-5-gebildeten diskontinuierlichen Strängen erklärt. Die Partikelkomplexe der diskontinuierlichen Stränge von Cld5 müssen demnach mit den Partikelkomplexen einer benachbarten Zelletrans-interagieren, um TJ- Stränge zu bilden. Bei den Partikelkomplexen handelt es sich möglicherweise um Cld5-Hexamere.

Ein weiterer Aspekt der Arbeit ist die Analyse der Wechselwirkungen zwischen der 2.EZS von Claudinen und Clostridium perfringens Enterotoxin (CPE). Durch die Analyse von membrangebundene Peptidbibliotheken wurde die Interaktion von CPE mit Peptiden der 2.EZS der Claudine 3, 6, 7, 9 und 14, nicht jedoch der Claudine 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10-13, 15, 18, 19, 20 und 22 aufgezeigt. Substitutionsanalysen mit membrangebundenen Peptidbibliotheken identifizierten das turn-Motiv NPLVP als essentiell für die Interaktion zwischen CPE und den isolierten 2.EZS von Claudinen. Im Gegensatz dazu scheint das turn-Motiv für die Interaktion von CPE mit nativen Cld-Molekülen auf der Zelloberfläche von Cld-exprimierenden Zellen ohne Bedeutung zu sein. Das deutet darauf hin, dass die bindungsrelevante Struktur der 2.EZS von Cld5 stark von der Membrantopologie der Claudine abhängt. Durch CPE-Bindungsstudien an transfizierten HEK-293-Zellen wurden zwei bindungsrelevante Aminosäuresubstitutionen, T151A und Q156E, in der 2.EZS von Cld5 identifiziert. Weiterhin wurde gezeigt, dass CPE an Cld-Moleküle außerhalb der TJs von Cld3- bzw. Cld5-exprimierenden HEK-293-Zellen bindet. Die CPE- induzierte Öffnung der TJs durch eine Störung des Polymerisations -/Depolymerisations-Gleichgewichts der Cld-Stränge ist daher wahrscheinlich.

Insgesamt tragen die durchgeführten Untersuchungen zu einem besseren Verständnis der TJ-Struktur bei. Zudem ermöglicht die Charakterisierung der CPE-Cld- bzw. Cld-Cld-Interaktion die Entwicklung von Peptiden oder niedermolekularen Substanzen, die gezielt TJs modulieren, um so z. B. die Wirkstoffzufuhr ins Gehirn zu verbessern.

In multicellular organisms, epithelia and endothelia form barriers to maintain the function of organs, but also to prevent the passage of drugs. To prevent diffusion of water soluble molecules through the paracellular pathway, the intercellular space between adjacent epithelial or endothelial cells is sealed by tight junctions (TJ). TJs appear in freeze-fracture replicas as intramembranous networks of strands on the apical end of the lateral surface of the cells. Structural backbone of the TJs in the specifically tight blood- brain barrier are the claudins (cld) 3 and 5. Cld5 is sealing the TJs of the blood-brain barrier for molecules <800 Da. In this thesis it is hypothesized that the TJ strands are formed and the paracellular space is tightened by homo- and heterophilic cis and trans interactions of claudins. The molecular interaction mechanism between claudins has been unknown.

The results demonstrate direct homophilic self-association of the second extracellular loop (2.ECL) of claudins 3 and 5 in size exclusion chromatography. Systematic amino acid substitutions of cld5 showed, that the 2.ECL is involved in homophilic trans-interactions, but not in cis- interactions. Molecular determinants important for trans-interaction were identified. HEK-293 cells were established as TJ-free cell system for the analysis of homophilic cis\- and trans-interaction, as well as strand formation by cld5, independent from the influence of endogenous claudins. The trans-interaction ability, analysed with confocal microscopy, and the subcellular localisation of the Cld mutants, determined by cell surface biotinylation and confocal microscopy, leads to structural models of a cld5-monomer and a homophilic cld5-trans-dimer. The sequence-homolog part of the structure of a hypothetical bacterial protein (BB2244) was assigned to the 2.ECL of cld5. According to this, the 2.ECL of cld5 (mouse) shows a helix- turn-helix motif, which is stabilized by the turn-conformation formed by a network of hydrogen bonds, the two proline P150 and P153, as well as hydrophobic side chain interactions between V152 and L160. In the homodimer model, the 2.ECLs trans-interact antiparallelly through aromatic residues (F147, Y148, Y158). A potential binding partner for the trans-interacting amino acids Q156 and E159 remain to be identified. The structural models are supposed to be adapted to claudins with high sequence homology to cld5, for the first time, defined as classical claudins 1-10, 14, 15, 17 and 19.

Moreover, the strand formation was analysed with respect to cis\- and trans- interactions. Freeze-fracture electron microscopy shows a strongly reduced number of intramembranous strands in mutants with disturbed trans-interaction although the cis-interaction is unimpaired. A mechanism is postulated which explains the morphology of cld-5-based discontinuous TJ strands. According to this, the particles in the discontinuous strands of cld5 trans-interact with the particles of the opposing cell to form continuous TJ strands in the paracellular space. We propose that these particles are composed by cld5-hexamers.

Another aspect of this thesis is the investigation of the interaction between the 2.ECL of claudins and Clostridium perfringens enterotoxin (CPE). As shown by the analysis of peptide array libraries, CPE is interacting with peptides from the 2.ECL of claudins 3, 6, 7, 9 and 14, but not with 2.ECL of claudins 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10-13, 15, 18, 19, 20 and 22. Substitution analysis, using peptide array libraries, identified the turn motif NPLVP as essential for interactions between CPE and the isolated 2.ECL of claudins. In contrast, the turn motif seems to be of no relevance for the interaction of CPE with native full-length Cld-5 molecules on the cell surface. This suggests that the binding-relevant structure of the 2.ECL from Cld5 depends strongly on the membrane topology. Incubations of transfected HEK-293 cells with CPE reveal two amino acids substitutions in the 2.ECL of Cld5, T151A and Q156E, that are mainly involved in the Cld-CPE-interactions. It is also shown that CPE does not bind directly to the TJs reconstituted by cld3 or cld5 expressed in HEK-293 cells, but binds to free cld3 or cld5 molecules on the plasma membrane. Hence, the CPE-induced opening of TJs is likely due to an imbalance of polymerisation and depolymerisation of the Cld strands.

Overall, these investigations lead to a better understanding of the TJ structure. The characterisation of the Cld-CPE and the Cld-Cld-interactions is thought to contribute to the design of peptides or low molecular weight substances for a direct modulation of the TJs to enhance the drug delivery to the blood-brain barrier.