In neuroscience, it is important to localize antigens to subcellular structures. For this purpose, electron microscopic immunocytochemical methods are used. Immunocytochemical labeling for electron microscopy is performed either prior to embedding the tissue in artificial resin, by so called pre- embedding techniques, or after embedding, by so called post-embedding techniques. For methodological reasons, e.g. possible quantification of the signal, post-embedding approaches are preferred. However, many antigens are not available for post-embedding labeling after the embedding step. Pre- embedding techniques not only provide an alternative, but are necessary for certain immunocytochemical approaches: on one hand for tracing studies, where synaptic connections between cell types of different brain areas must be unequivocally identified in double (or multiple) labeling studies. On the other hand for correlative light and electron microscopy, a synergistic approach, which allows for the pre-examination of large tissue areas and identification of regions of interest (ROI) by fluorescence microscopy screening, followed by analysis of the ultrastructure of the ROIs by electron microscopy. Routinely used pre-embedding techniques, however, such as the combination of peroxidase and benzidine-compounds or the immunogold-silver- enhancement method (IGE), suffer from distinctive drawbacks. Benzidine- peroxidase techniques allow only limited fine localization owing to the diffusibility of the reaction products, while IGE may be considered less sensitive and reproducible. In the present thesis, a novel method utilizing haptens, i.e. small and chemically inert molecules like biotin, combining the pre- and postembedding techniques was tested as an alternative electron microscopic labeling technique in rat brain tissue sections. In the pre- embedding step, antigens were indirectly labeled with haptens. The haptens were introduced into the tissue either coupled to antibodies or by use of a peroxidase-based hapten amplification system, i.e. catalyzed reporter deposition (CARD). After embedding, instead of the original antigen, the haptens introduced were labeled in a post-embedding step. This approach was termed “virtual pre-embedding” (VirP) in this work. While hapten-coupled primary antibodies yielded no signal with virtual pre-embedding, with hapten- coupled secondary antibodies, a comparatively weak but clearly specific and reproducible VirP signal was obtained. The most promising results were attained with the CARD-based deposition of haptens offering considerable advantages over routinely used pre-embedding methods: This approach yielded a sensitive, specific and reproducible signal with excellent contrast for four different haptens as reporter molecules. Moreover, it was shown that CARD VirP was suited for double-labeling with IGE and for correlative fluorescence and electron microscopy using a fluorescent hapten. In conclusion, CARD virtual pre-embedding was successfully introduced as an alternative method for pre- embedding labeling, double labeling studies and correlative fluorescence and electron microscopy. This suggests that virtual pre-embedding will provide a useful tool for future immunocytochemical studies of brain function.
Die präzise subzelluläre Lokalisation von Antigenen ist in den Neurowissenschaften von großer Bedeutung. Zu diesem Zweck werden elektronenmikroskopisch-immuncytochemische Methoden eingesetzt. Die Markierung des Gewebes mit Antikörpern wird für die Elektronenmikroskopie entweder vor der Einbettung des Gewebes in Kunstharz, im so genannten „pre- embedding“-Verfahren, oder nach der Einbettung, im so genannten „post- embedding“-Verfahren, durchgeführt. Im Unterschied zum „pre- embedding“-Verfahren sind im „post-embedding“-Verfahren alle zellulären Kompartimente gleichermaßen zugänglich und die Markierungen quantifizierbar. Da jedoch viele Antigene nach der Einbettung im „post-embedding“-Verfahren mit den zur Verfügung stehenden Antikörpern nicht nachweisbar sind, werden häufig alternativ „pre-embedding“-Methoden eingesetzt. Darüber hinaus sind „pre- embedding“-Verfahren essentiell für tracing Studien, mit deren Hilfe synaptische Verbindungen zwischen bestimmten Hirnarealen unter Verwendung immuncytochemischer Doppel- (oder Mehrfach)markierungen identifiziert werden und für die Korrelation von Licht- und Elektronenmikroskopie. Hierbei handelt es sich um einen synergistischen Ansatz, welcher es erlaubt, mittels Fluoreszenzmikroskopie großflächig Gewebeanteile zu untersuchen und dann kleinere Regionen von Interesse zu definieren, deren Ultrastruktur nachfolgend mittels Elektronenmikroskopie untersucht werden kann. Für diese Zwecke haben sich im wesentlichen zwei „pre-embedding“-Techniken bewährt, zum einen die Kombination des Enzyms Peroxidase mit Benzidinderivaten und zum anderen die Immunogold-Silberverstärkung (IGE). Peroxidase-Benzidin-Techniken sind durch eine eingeschränkte Feinlokalisation gekennzeichnet, während die Sensitivität des IGE-Verfahrens bei relativ schwach exprimierten Antigenen zum limitierenden Faktor werden kann. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Ansatz untersucht, bei dem durch die Kombination von „pre-„ und „post- embedding“-Techniken unter Verwendung von Haptenen elektronenmikroskopische Markierungen an Hirnschnitten der Ratte durchgeführt wurden. Im „pre- embedding“-Schritt wurden dabei Antigene mit Haptenen markiert. Die Haptene wurden entweder an Antikörper gekoppelt oder durch ein Peroxidase-basiertes Hapten-Amplifikationssystem (CARD, CAtalyzed Reporter Deposition) in das Gewebe eingebracht. Nach der Einbettung wurden in einem „post-embedding“- Schritt nun die Haptene und nicht das ursprüngliche Antigen markiert. Dieser Ansatz wurde in der vorliegenden Arbeit „virtuelles pre-embedding“ (VirP) genannt. Während mittels an Primärantikörper gekoppelter Haptene kein VirP- Signal erzielt werden konnte, war mit an Sekundärantikörper gekoppelten Haptenen ein verhältnismäßig schwaches, jedoch klar spezifisches und reproduzierbares Signal nachweisbar. Die vielversprechendsten Ergebnisse konnten mit der CARD-basierten Verstärkung der Haptenablagerung erzielt werden. Diese Methode verbindet eine durch die Signalverstärkung erzielte hohe Sensitivität mit den Vorteilen eines partikulären Markersystems. Das erzielte spezifische Signal zeichnete sich bei allen vier untersuchten Haptenen durch hohe Sensitivität, gute Reproduzierbarkeit und leichte Darstellbarkeit aus. VirP eignet sich zudem für Doppelmarkierungen in Kombination mit IGE und für korrelative Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie unter Nutzung eines fluoreszierenden Haptens. Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit CARD-basiertes VirP erfolgreich als alternative Methode für herkömmliche pre- embedding Markierungen, für Doppelmarkierungsstudien und die Korrelation von Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie angewendet. Diese Ergebnisse legen nahe, dass VirP sich als eine neue, breit anwendbare Methode für die Untersuchung von Gehirnstruktur und -funktion etablieren könnte.
