dc.contributor.author
Madai, Vince István
dc.date.accessioned
2018-06-08T00:02:17Z
dc.date.available
2012-06-13T10:09:19.399Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11368
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-15566
dc.description.abstract
In neuroscience, it is important to localize antigens to subcellular
structures. For this purpose, electron microscopic immunocytochemical methods
are used. Immunocytochemical labeling for electron microscopy is performed
either prior to embedding the tissue in artificial resin, by so called pre-
embedding techniques, or after embedding, by so called post-embedding
techniques. For methodological reasons, e.g. possible quantification of the
signal, post-embedding approaches are preferred. However, many antigens are
not available for post-embedding labeling after the embedding step. Pre-
embedding techniques not only provide an alternative, but are necessary for
certain immunocytochemical approaches: on one hand for tracing studies, where
synaptic connections between cell types of different brain areas must be
unequivocally identified in double (or multiple) labeling studies. On the
other hand for correlative light and electron microscopy, a synergistic
approach, which allows for the pre-examination of large tissue areas and
identification of regions of interest (ROI) by fluorescence microscopy
screening, followed by analysis of the ultrastructure of the ROIs by electron
microscopy. Routinely used pre-embedding techniques, however, such as the
combination of peroxidase and benzidine-compounds or the immunogold-silver-
enhancement method (IGE), suffer from distinctive drawbacks. Benzidine-
peroxidase techniques allow only limited fine localization owing to the
diffusibility of the reaction products, while IGE may be considered less
sensitive and reproducible. In the present thesis, a novel method utilizing
haptens, i.e. small and chemically inert molecules like biotin, combining the
pre- and postembedding techniques was tested as an alternative electron
microscopic labeling technique in rat brain tissue sections. In the pre-
embedding step, antigens were indirectly labeled with haptens. The haptens
were introduced into the tissue either coupled to antibodies or by use of a
peroxidase-based hapten amplification system, i.e. catalyzed reporter
deposition (CARD). After embedding, instead of the original antigen, the
haptens introduced were labeled in a post-embedding step. This approach was
termed “virtual pre-embedding” (VirP) in this work. While hapten-coupled
primary antibodies yielded no signal with virtual pre-embedding, with hapten-
coupled secondary antibodies, a comparatively weak but clearly specific and
reproducible VirP signal was obtained. The most promising results were
attained with the CARD-based deposition of haptens offering considerable
advantages over routinely used pre-embedding methods: This approach yielded a
sensitive, specific and reproducible signal with excellent contrast for four
different haptens as reporter molecules. Moreover, it was shown that CARD VirP
was suited for double-labeling with IGE and for correlative fluorescence and
electron microscopy using a fluorescent hapten. In conclusion, CARD virtual
pre-embedding was successfully introduced as an alternative method for pre-
embedding labeling, double labeling studies and correlative fluorescence and
electron microscopy. This suggests that virtual pre-embedding will provide a
useful tool for future immunocytochemical studies of brain function.
de
dc.description.abstract
Die präzise subzelluläre Lokalisation von Antigenen ist in den
Neurowissenschaften von großer Bedeutung. Zu diesem Zweck werden
elektronenmikroskopisch-immuncytochemische Methoden eingesetzt. Die Markierung
des Gewebes mit Antikörpern wird für die Elektronenmikroskopie entweder vor
der Einbettung des Gewebes in Kunstharz, im so genannten „pre-
embedding“-Verfahren, oder nach der Einbettung, im so genannten „post-
embedding“-Verfahren, durchgeführt. Im Unterschied zum „pre-
embedding“-Verfahren sind im „post-embedding“-Verfahren alle zellulären
Kompartimente gleichermaßen zugänglich und die Markierungen quantifizierbar.
Da jedoch viele Antigene nach der Einbettung im „post-embedding“-Verfahren mit
den zur Verfügung stehenden Antikörpern nicht nachweisbar sind, werden häufig
alternativ „pre-embedding“-Methoden eingesetzt. Darüber hinaus sind „pre-
embedding“-Verfahren essentiell für tracing Studien, mit deren Hilfe
synaptische Verbindungen zwischen bestimmten Hirnarealen unter Verwendung
immuncytochemischer Doppel- (oder Mehrfach)markierungen identifiziert werden
und für die Korrelation von Licht- und Elektronenmikroskopie. Hierbei handelt
es sich um einen synergistischen Ansatz, welcher es erlaubt, mittels
Fluoreszenzmikroskopie großflächig Gewebeanteile zu untersuchen und dann
kleinere Regionen von Interesse zu definieren, deren Ultrastruktur nachfolgend
mittels Elektronenmikroskopie untersucht werden kann. Für diese Zwecke haben
sich im wesentlichen zwei „pre-embedding“-Techniken bewährt, zum einen die
Kombination des Enzyms Peroxidase mit Benzidinderivaten und zum anderen die
Immunogold-Silberverstärkung (IGE). Peroxidase-Benzidin-Techniken sind durch
eine eingeschränkte Feinlokalisation gekennzeichnet, während die Sensitivität
des IGE-Verfahrens bei relativ schwach exprimierten Antigenen zum
limitierenden Faktor werden kann. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer
Ansatz untersucht, bei dem durch die Kombination von „pre-„ und „post-
embedding“-Techniken unter Verwendung von Haptenen elektronenmikroskopische
Markierungen an Hirnschnitten der Ratte durchgeführt wurden. Im „pre-
embedding“-Schritt wurden dabei Antigene mit Haptenen markiert. Die Haptene
wurden entweder an Antikörper gekoppelt oder durch ein Peroxidase-basiertes
Hapten-Amplifikationssystem (CARD, CAtalyzed Reporter Deposition) in das
Gewebe eingebracht. Nach der Einbettung wurden in einem „post-embedding“-
Schritt nun die Haptene und nicht das ursprüngliche Antigen markiert. Dieser
Ansatz wurde in der vorliegenden Arbeit „virtuelles pre-embedding“ (VirP)
genannt. Während mittels an Primärantikörper gekoppelter Haptene kein VirP-
Signal erzielt werden konnte, war mit an Sekundärantikörper gekoppelten
Haptenen ein verhältnismäßig schwaches, jedoch klar spezifisches und
reproduzierbares Signal nachweisbar. Die vielversprechendsten Ergebnisse
konnten mit der CARD-basierten Verstärkung der Haptenablagerung erzielt
werden. Diese Methode verbindet eine durch die Signalverstärkung erzielte hohe
Sensitivität mit den Vorteilen eines partikulären Markersystems. Das erzielte
spezifische Signal zeichnete sich bei allen vier untersuchten Haptenen durch
hohe Sensitivität, gute Reproduzierbarkeit und leichte Darstellbarkeit aus.
VirP eignet sich zudem für Doppelmarkierungen in Kombination mit IGE und für
korrelative Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie unter Nutzung eines
fluoreszierenden Haptens. Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit
CARD-basiertes VirP erfolgreich als alternative Methode für herkömmliche pre-
embedding Markierungen, für Doppelmarkierungsstudien und die Korrelation von
Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie angewendet. Diese Ergebnisse legen
nahe, dass VirP sich als eine neue, breit anwendbare Methode für die
Untersuchung von Gehirnstruktur und -funktion etablieren könnte.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
immunocytochemistry
dc.subject
electron microscopy
dc.subject
correlative imaging
dc.subject
pre-embedding labeling
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Virtual pre-embedding labeling
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. R. W. Veh
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. J. H. R. Lübke
dc.contributor.furtherReferee
Ph.D. D. S. Zahm
dc.date.accepted
2012-06-03
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000037352-4
dc.title.subtitle
a method for correlative fluorescence and electron microscopic imaging and
double-labeling in the central nervous system of the rat
dc.title.translated
Virtuelles Pre-Embedding Labeling
de
dc.title.translatedsubtitle
eine Methode für die korrelative Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie und
für die Doppelmarkierung im Gewebe des zentralen Nervensystems der Ratte
de
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000037352
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000011002
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access