Phytochrome sind Photorezeptoren, die das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen in Abhängigkeit von rotem/dunkelrotem Licht vermitteln. Im Rahmen dieser Dissertation wurden Lösungs-NMR-Studien an der N-terminalen photosensorischen Domäne des cyanobakteriellen Phytochroms 1 (Cph1Δ2) aus Synechocystis PCC6803 und an dessen kovalent gebundenen Chromophor Phycocyanobilin (PCB) vorgenommen. Mit den Ergebnissen sollten Aussagen zur Detektion des Lichtsignals durch den Chromophor sowie der Weitergabe des Signals an das Protein zur Initiation der Signalstransduktionskaskade getroffen werden. Als erste Resultate konnten nach Aufnahme von [15N]-1D und -HMQC-Spektren mit [15N]-PCB in deuteriertem Apoprotein und nach Vergleich der Spektren mit denen geeigneter Modellsubstanzen wie α-C-Phycocyanin die [15N]-chemischen Verschiebungen der Pyrrol-Stickstoffe des PCB zugeordnet werden. Es konnte eindeutig bestätigt werden, dass der Chromophor in den beiden stabilen Photoisomeren Pr und Pfr vollständig protoniert ist. In einem [13C]-HMQC-Spektrum von [13C]-PCB in deuteriertem Apoprotein konnten lediglich die Methylgruppen des Chromophors, nicht jedoch die Methinbrücken detektiert werden. Trotzdem war es nach Aufnahme weiterer 2D-NOESY- und [13C]-editierter 3D-HMQC-NOESY-Spektren möglich, Resonanzen zuzuordnen und die allgemeine Konformation des Chromophors in der Proteinbindetasche für Pr (ZZZssa) und Pfr (ZZEssa) zu bestimmen. Die ermittelte Pr-Konformation stimmt mit der des PCB- Chromophors in der kürzlich veröffentlichten 3D-Kristallstruktur desselben Proteins (PDB-Code: 2vea) überein. Die Pfr-Konformation eines Phytochromchromophors war bis zu diesem Zeitpunkt nicht bekannt. Die spezifische Dynamik des Chromophors in der Proteinbindetasche beeinflusste die Aufnahme aller Spektren. Sie ergibt sich zum einen aus dem Austausch der Pyrrol-Protonen des Chromophors mit dem umgebenden Wasser, zum anderen aus konformationellen Subzuständen (räumliche Beweglichkeit innerhalb einer spezifischen s\- oder a-Konformation), die der Chromophor einnimmt. Beides führte koaleszenzbedingt zu einer starken Verbreiterung der Signale. Man kann davon ausgehen, dass der Chromophor deutlich weniger stark als z.B. in α-C-Phycocyanin durch ein Wasserstoffbrückennetzwerk positioniert wird. Er ist dementsprechend sehr beweglich und seine Pyrrol-Protonen sind dem umgebenden Wasser exponiert. Allerdings nimmt die Beweglichkeit innerhalb des Chromophors vom D-Ring hin zum A-Ring ab. Mit diesen Ergebnissen sowie unter Einbeziehung weiterer Untersuchungen kann geschlussfolgert werden, dass keine starke Konformationsänderung des Chromophors strukturelle Veränderungen im Protein bewirkt, sondern eine Umordnung des Wasserstoffbrückennetzwerkes als Folge der Rotation des D-Rings nach Lichtdetektion dabei eine Rolle spielt. Zusammen mit einem Protonentranslokationsprozess könnten so größere strukturelle Umordnungen im Protein bewirkt werden, die die Signalweiterleitung beeinflussen.
Phytochromes are photoreceptors that mediate plant growth and development in response to red/far-red light. In this thesis solution-state NMR studies on the N-terminal photosensory domain of cyanobacterial phytochrome 1 (Cph1Δ2) from Synechocystis PCC6803 and its covalently attached phycocyanobilin (PCB) chromophore were performed. The results should promote a deeper understanding of the photoconversion mechanism by giving new hints on how an incoming light signal is detected by the chromophore and how it is passed on to the protein to initiate the signalling cascade. As first results it was possible to assign the tetrapyrrole nitrogen chemical shifts of the PCB-chromophore after recording [15N]-1D and -HMQC spectra of deuterated protein + [15N]-PCB and comparison of the obtained resonances with those from appropriate model compounds like α-C-phycocyanin. With these experiments the complete protonation of the chromophore in the two stable photoisomers Pr and Pfr could been proven. In [13C]-HMQC spectra using deuterated protein + [13C]-PCB the chromophore methyl groups but not the methine bridges could be detected. After recording additional 2D-NOESY and [13C]-edited 3D-HMQC-NOESY spectra it was, however, possible to assign resonances and to determine the overall conformation of the chromophore in the binding pocket to be ZZZssa in Pr and ZZEssa in Pfr. The Pr conformation is consistent with those determined for the PCB-chromophore in the recently published 3D crystal structure of the same protein (PDB-code: 2vea). For the Pfr-form of an intact phytochrome no comparable information was available by that time. The recording of all spectra was influenced by the specific dynamics of the chromophore in the binding pocket. It arises on one hand from an exchange of acidic protons in the molecule with protons from the surrounding solvent, on the other hand from the existence of certain conformational substates (within one defined s\- or a-conformation). Both exchange phenomena led to strong broadening of all signals. It can be deduced that the chromophore in Cph1 is positioned in a weaker hydrogen bonding network compared to the chromophore in α-C-phycocyanin. It is thus more flexible and its pyrrole protons are solvent exposed. The flexibility within the chromophore itself decreases from the D-ring to the A-ring. These results and those from further experiments allow the conclusion that the rotation of ring D after detection of the light signal does not directly affect structural changes in the protein but rather leads to a rearrangement of the hydrogen bonding pattern in the surrounding protein binding pocket. Together with a proton translocation process this altered H-bonding network can provoke an overall structural change in the protein that promotes signal transduction.
