Der wiederholte Nachweis der als Zoonoseerreger geltenden opisthorchiiden Leberegel bei den entsprechenden End- und Zwischenwirten im Gebiet von Berlin- Brandenburg ließ erkennen, dass diese Trematoden auch in Deutschland eine potentielle Gefahr fur die einheimische Bevolkerung darstellen. Da eine Differenzierung der Eier verschiedener opisthorchiider Leberegelspezies im Kot der Endwirte mittels Lichtmikroskopie nicht moglich ist, entstand die Idee, den Nachweis und die Unterscheidung der Eier mittels molekularbiologischer Methoden (PCR und RFLP-Analyse) zu fuhren. Hierfur wurde zunachst ein Verfahren entwickelt, mit welchem adulte Exemplare der verschiedenen Trematodenspezies differenziert werden konnten. Die benotigten adulten Leberegel wurden einerseits aus experimentell infizierten Saugetieren und Vogeln, andererseits aus naturlich infizierten Endwirten isoliert. Mit Hilfe von Primern, die eine Teilsequenz der mitochondrialen Cytochrom C Oxidase I (COI) in der PCR amplifizieren, konnten Produkte von ca. 440 bp fur die untersuchten opisthorchiiden Trematodenarten (O. felineus, C. sinensis, M. bilis, M. xanthosomus, P. truncatum) und ein Produkt von ca. 630 bp fur die Spezies O. viverrini gewonnen werden. Auf dieser Ebene war bereits eine Differenzierung der morphologisch nicht unterscheidbaren Exemplare von O. felineus und O. viverrini moglich. Da die eingesetzten COI-Primer aber mit der DNA verschiedener Zestoden der Fleischfresser kreuz reagierten, wurden die Amplifikate der untersuchten opisthorchiiden Trematodenspezies sequenziert, um anhand der vorliegenden Sequenzen speziesspezifische Primer zu konstruieren, die jeweils nur in der entsprechenden variablen Region der Teilsequenz des COI-Gens binden. Solche spezifischen Primer konnten zunachst fur die am haufigsten vorkommenden einheimischen Arten O. felineus und M. bilis synthetisiert werden (OF- und MB-Primer). Diese wurden mit DNA von je 10 O. felineus und 10 M. bilis, die aus verschiedenen Endwirten isoliert worden waren, sowie mit DNA von P. truncatum, von Zestoden und mit DNA der Zwischenwirtsspezies getestet. Außerdem erfolgte die Überprufung der analytischen Sensitivitat durch Verdunnung von 20 ng DNA je eines O. felineus- und M. bilis-Isolats bis zu einem Gehalt von 1 fg. Bei den durchgefuhrten Versuchen ergab sich eine Spezifitat von 100% fur OF- und MB-Primer. Die Nachweisgrenze fur O. felineus- DNA lag bei 10 pg, die fur M. bilis-DNA bei 100 fg. Durch Einsatz von OF- und MB-Primern war es außerdem moglich, DNA opisthorchiider Trematodeneier im Kot experimentell infizierter Silberfuchse nachzuweisen und zu differenzieren. Die hierbei aufgetretenen Probleme werden in der vorliegenden Arbeit diskutiert. Als weitere Methode der molekularen Differenzierung diente die RFLP-Analyse von COI-Amplifikaten der Spezies O. felineus, O. viverrini, C. sinensis, M. bilis und P. truncatum unter Verwendung der Endonukleasen Alu I und Hha I. Dabei konnte bereits durch den alleinigen Einsatz von Alu I eine Unterscheidung der oben angefuhrten Arten erreicht werden. Insgesamt kann festgehalten werden, dass die in den eigenen Untersuchungen etablierte PCR und RFLP-Analyse zur molekularen Differenzierung von opisthorchiiden Leberegeln herangezogen werden kann. Die verwendeten Methoden konnen als Grundlage fur weiterfuhrende Studien dienen, z.B. fur den Nachweis und die Differenzierung opisthorchiider Metazerkarien im Fischgewebe oder parthenogenetischer Stadien opisthorchiider Trematoden in Zwischenwirtsschnecken.
Repeated findings of opisthorchiid liver flukes, which are zoonotic agents, in intermediate and definitive hosts in the area of Berlin-Brandenburg indicates, that these trematodes are a potential risk for the indigenous human population in Germany. Since the differentiation of opisthorchiid eggs, which belong to different species, is not possible in the feces of final hosts using light- microscopy, the idea was borne to detect and differentiate these eggs with molecular methods (PCR = Polymerase chain reaction and RFLP-analysis = Restrictionfragment-length-polymorphism-analysis). For this a method was developed, by the aid of which adult specimens of the different opisthorchiid species could be distinguished. The required liver flukes were isolated from experimental infected mammals and birds or from natural infected definitive hosts. Using a primer-pair, which amplified a partial sequence of mitochondrial cytochrome C oxidase I (COI) in PCR, products of nearly 440 bp (bp = basepairs) for the examined species (O. felineus, C. sinensis, M. bilis, M. xanthosomus and P. truncatum) and a product of nearly 630 bp for O. viverrini were obtained. Already at this level the differentiation of morphologically not distinguishable specimens of O. felineus and O. viverrini was possible. Since COI-primers showed crossreactivity with the DNA of different cestodes of carnivores, the amplicons of the examined opisthorchiid trematodes were analysed by sequencing. The obtained sequences were used to construct species specific primers, which bind only in the variable region of the partial sequence of the COI-gene. Such specific primers could be synthesized first of all for the most common indigenous species O. felineus and M. bilis (OF- and MB-primers). These primers were tested with DNA of each ten O. felineus and M. bilis, which were isolated from different final hosts, as well as with DNA of P. truncatum, cestodes and DNA of intermediate hosts (cyprinid fish and snails of the genus Bithynia). Furthermore the analytical sensitivity was examined using dilutions from 20 ng of DNA to 1 fg of DNA from an O. felineus and a M. bilis sample. A specifity of 100% for OF- and MB-primers were obtained in the performed experiments. The limit to detect O. felineus-DNA was 10 pg, for DNA of M. bilis it was 100 fg. Using OF- and MB-primers it was also possible to detect and differentiate DNA of opisthorchiid eggs in feces of experimental infected silver foxes. The problems occurring in this experiment are discussed in this thesis. RFLP-analysis of COI-amplicons from the species O. felineus, O. viverrini, C. sinensis, M. bilis and P. truncatum using endonucleases Alu I and Hha I is a further method of molecular differentiation. It was already possible to differentiate all described species using Alu I only. In conclusion it could be stated, that the established PCR and RFLP-analysis are suitable tools to differentiate opisthorchiid liver flukes. The developed methods are considered as a basis for further investigations, e.g. the detection and differentiation of opisthorchiid metacercariae in fishtissues or of parthenogenetic stages of opisthorchiid trematodes in snail intermediate hosts.
