dc.contributor.author
Pauly, Andreas Karl
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:50:01Z
dc.date.available
2003-09-07T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11062
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-15260
dc.description
Titelblatt, Inhalts- und Abkurzungsverzeichnis, Lebenslauf, Danksagung
1\. Aufgabenstellung
2\. Literaturubersicht
3\. Material und Methoden
4.1 Ergebnisse Teil I
4.2 Ergebnisse Teil II
5\. Diskussion
6\. Zusammenfassung / Summary
7\. Literaturverzeichnis
8\. Anhang
dc.description.abstract
Der wiederholte Nachweis der als Zoonoseerreger geltenden opisthorchiiden
Leberegel bei den entsprechenden End- und Zwischenwirten im Gebiet von Berlin-
Brandenburg ließ erkennen, dass diese Trematoden auch in Deutschland eine
potentielle Gefahr fur die einheimische Bevolkerung darstellen. Da eine
Differenzierung der Eier verschiedener opisthorchiider Leberegelspezies im Kot
der Endwirte mittels Lichtmikroskopie nicht moglich ist, entstand die Idee,
den Nachweis und die Unterscheidung der Eier mittels molekularbiologischer
Methoden (PCR und RFLP-Analyse) zu fuhren. Hierfur wurde zunachst ein
Verfahren entwickelt, mit welchem adulte Exemplare der verschiedenen
Trematodenspezies differenziert werden konnten. Die benotigten adulten
Leberegel wurden einerseits aus experimentell infizierten Saugetieren und
Vogeln, andererseits aus naturlich infizierten Endwirten isoliert.
Mit Hilfe von Primern, die eine Teilsequenz der mitochondrialen Cytochrom C
Oxidase I (COI) in der PCR amplifizieren, konnten Produkte von ca. 440 bp fur
die untersuchten opisthorchiiden Trematodenarten (O. felineus, C. sinensis, M.
bilis, M. xanthosomus, P. truncatum) und ein Produkt von ca. 630 bp fur die
Spezies O. viverrini gewonnen werden. Auf dieser Ebene war bereits eine
Differenzierung der morphologisch nicht unterscheidbaren Exemplare von O.
felineus und O. viverrini moglich. Da die eingesetzten COI-Primer aber mit der
DNA verschiedener Zestoden der Fleischfresser kreuz reagierten, wurden die
Amplifikate
der untersuchten opisthorchiiden Trematodenspezies sequenziert, um anhand der
vorliegenden Sequenzen speziesspezifische Primer zu konstruieren, die jeweils
nur in der entsprechenden variablen Region der Teilsequenz des COI-Gens
binden. Solche spezifischen Primer konnten zunachst fur die am haufigsten
vorkommenden einheimischen Arten O. felineus und M. bilis synthetisiert werden
(OF- und MB-Primer). Diese wurden mit DNA von je 10 O. felineus und 10 M.
bilis, die aus verschiedenen Endwirten isoliert worden waren, sowie mit DNA
von P. truncatum, von Zestoden und mit DNA der Zwischenwirtsspezies getestet.
Außerdem erfolgte die Überprufung der analytischen Sensitivitat durch
Verdunnung von 20 ng DNA je eines O. felineus- und M. bilis-Isolats bis zu
einem Gehalt von 1 fg. Bei den durchgefuhrten Versuchen ergab sich eine
Spezifitat von 100% fur OF- und MB-Primer. Die Nachweisgrenze fur O. felineus-
DNA lag bei 10 pg, die fur M. bilis-DNA bei 100 fg. Durch Einsatz von OF- und
MB-Primern war es außerdem moglich, DNA opisthorchiider Trematodeneier im Kot
experimentell infizierter Silberfuchse nachzuweisen und zu differenzieren. Die
hierbei aufgetretenen Probleme werden in der vorliegenden Arbeit diskutiert.
Als weitere Methode der molekularen Differenzierung diente die RFLP-Analyse
von COI-Amplifikaten der Spezies O. felineus, O. viverrini, C. sinensis, M.
bilis und P. truncatum unter Verwendung der Endonukleasen Alu I und Hha I.
Dabei konnte bereits durch den alleinigen Einsatz von Alu I eine
Unterscheidung der oben angefuhrten Arten erreicht werden.
Insgesamt kann festgehalten werden, dass die in den eigenen Untersuchungen
etablierte PCR und RFLP-Analyse zur molekularen Differenzierung von
opisthorchiiden Leberegeln herangezogen werden kann. Die verwendeten Methoden
konnen als Grundlage fur weiterfuhrende Studien dienen, z.B. fur den Nachweis
und die Differenzierung opisthorchiider Metazerkarien im Fischgewebe oder
parthenogenetischer Stadien opisthorchiider Trematoden in
Zwischenwirtsschnecken.
de
dc.description.abstract
Repeated findings of opisthorchiid liver flukes, which are zoonotic agents, in
intermediate and definitive hosts in the area of Berlin-Brandenburg indicates,
that these trematodes are a potential risk for the indigenous human population
in Germany. Since the differentiation of opisthorchiid eggs, which belong to
different species, is not possible in the feces of final hosts using light-
microscopy, the idea was borne to detect and differentiate these eggs with
molecular methods (PCR = Polymerase chain reaction and RFLP-analysis =
Restrictionfragment-length-polymorphism-analysis). For this a method was
developed, by the aid of which adult specimens of the different opisthorchiid
species could be distinguished. The required liver flukes were isolated from
experimental infected mammals and birds or from natural infected definitive
hosts.
Using a primer-pair, which amplified a partial sequence of mitochondrial
cytochrome C oxidase I (COI) in PCR, products of nearly 440 bp (bp =
basepairs) for the examined species (O. felineus, C. sinensis, M. bilis, M.
xanthosomus and P. truncatum) and a product of nearly
630 bp for O. viverrini were obtained. Already at this level the
differentiation of morphologically not distinguishable specimens of O.
felineus and O. viverrini was possible. Since COI-primers showed
crossreactivity with the DNA of different cestodes of carnivores, the
amplicons of the examined opisthorchiid trematodes were analysed by
sequencing. The obtained sequences were used to construct species specific
primers, which bind only in the variable region of the partial sequence of the
COI-gene. Such specific primers could be synthesized first of all for the most
common indigenous species O. felineus and M. bilis (OF- and MB-primers). These
primers were tested with DNA of each ten O. felineus and M. bilis, which were
isolated from different final hosts, as well as with DNA of P. truncatum,
cestodes and DNA of intermediate hosts (cyprinid fish and snails of the genus
Bithynia). Furthermore the analytical sensitivity was examined using dilutions
from 20 ng of DNA to 1 fg of DNA from an O. felineus and a M. bilis sample. A
specifity of 100% for OF- and MB-primers were obtained in the performed
experiments. The limit to detect O. felineus-DNA was 10 pg, for DNA of M.
bilis it was 100 fg.
Using OF- and MB-primers it was also possible to detect and differentiate DNA
of opisthorchiid eggs in feces of experimental infected silver foxes. The
problems occurring in this experiment are discussed in this thesis.
RFLP-analysis of COI-amplicons from the species O. felineus, O. viverrini, C.
sinensis, M. bilis and P. truncatum using endonucleases Alu I and Hha I is a
further method of molecular differentiation. It was already possible to
differentiate all described species using Alu I only.
In conclusion it could be stated, that the established PCR and RFLP-analysis
are suitable tools to differentiate opisthorchiid liver flukes. The developed
methods are considered as a basis for further investigations, e.g. the
detection and differentiation of opisthorchiid metacercariae in fishtissues or
of parthenogenetic stages of opisthorchiid trematodes in snail intermediate
hosts.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Opisthorchis felineus
dc.subject
Molecular biology
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
Molekulare Charakteristik von adulten Trematoden der Familie Opisthorchiidae
mittels PCR und RFLP-Analyse
dc.contributor.firstReferee
Prof.-Dr. R. K. Schuster
dc.contributor.furtherReferee
Prof.-Dr. M. F. G. Schmidt
dc.contributor.furtherReferee
Prof.-Dr. Dr. Th. Hiepe
dc.date.accepted
2003-08-15
dc.date.embargoEnd
2003-10-02
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2003002308
dc.title.subtitle
Mit einem Beitrag zum molekularen Nachweis von Eiern der Arten Opisthorchis
felineus (Rivolta, 1884) und Metorchis bilis (Braun, 1790) im Kot von Füchsen
dc.title.translated
Molecular characterization of trematodes of the family Opisthorchiidae using
PCR and RFLP-analysis
en
dc.title.translatedsubtitle
including a contribution to the molecular detection of eggs from the species
Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884) and Metorchis bilis (Braun, 1790) in
fecal samples of foxes
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000001078
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2003/230/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000001078
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access