Structural Determinants for Histone and Inhibitor Recognition by the Bromodomain Protein 4

Abstract

Bromodomain protein 4 (BRD4) is a member of the bromodomain and extra-terminal domain (BET) protein family. It binds to acetylated histone tails via its tandem bromodomains BD1 and BD2, and forms a complex with the positive transcription elongation factor b which controls phosphorylation of RNA polymerase II, ultimately leading to stimulation of transcription elongation. An essential role of BRD4 in cell proliferation and cancer growth has been reported in several recent studies. Here the binding of BRD4 BD1 and BD2 to different partners was analyzed and showed that the strongest interactions took place with di- and tetra-acetylated peptides derived from the histone 4 (H4) N-terminal tail. Several H4 residues neighboring the acetylated lysines were also found to significantly influence binding. Ten different BRD4 BD1 mutants were generated and their affinities to acetylated histone tails and to the BET inhibitor JQ1 were analyzed using several complementary biochemical and biophysical methods. Altogether, the results show that W81, Y97, N140 and M149 play similarly important roles in the recognition of acetylated histones and JQ1. P82, L94, D145 and I146 have a more differentiated role, suggesting that different kinds of interactions take place and that resistance mutations compatible with BRD4 function are possible. The impact of the key mutations was further analyzed in a cellular environment. Our study extends the knowledge on the contribution of individual BRD4 amino acids to histone and JQ1 binding, and may help in the design of new BET antagonists with improved pharmacological properties.

Bromodomain Protein 4 (BRD4) ist ein Mitglied der Bromodomain und extra- terminalen Domain (BET) Proteinfamilie. Es bindet an azetylierte Histone über seine beide Bromodomäne BD1 und BD2 und bildet einen Komplex mit dem positiven Transkriptionselongationsfaktor b, der die Phosphorylierung von RNA-Polymerase II steuert, und letztlich zu einer Stimulation der Transkriptionselongation führt. Die wesentliche Rolle von BRD4 bei der Zellproliferation und Krebswachstum wurde in mehreren Studien berichtet. Hier wurde die Bindung von BRD4 BD1 und BD2 zu verschiedenen Partnern analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die stärksten Wechselwirkungen mit Di- und Tetra-acetylierte Peptide aus dem Histon 4 (H4) erfolgten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass mehrere H4 Aminosäuren in der Nähe der azetylierten Lysinen auch maßgeblich die Bindung beeinflussen. Zehn verschiedene BRD4 BD1 Mutanten wurden erzeugt und ihre Affinitäten zu dem azetyliertem Histonende und dem BETInhibitor JQ1 wurden mit mehreren biochemischen und biophysikalischen Methoden untersucht. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass W81, Y97, N140 und M149 eine ähnliche wichtige Rolle spielen bei der Erkennung von azetylierten Histonen und von JQ1. P82, L94, D145 und I146 haben eine differenziertere Rolle, was darauf hinweist, dass verschiedene Arten von Wechselwirkungen stattfinden und dass Resistenzmutationen mit BRD4-Funktion kompatibel sind. Die Auswirkungen der Schlüsselmutationen wurden anschließend in einer zellulären Umgebung analysiert. Unsere Studie erweitert das Wissen über den Beitrag einzelner BRD4 Aminosäuren zur Histon- und JQ1-Bindung und kann bei der zukünftigen Gestaltung neuen BET-Antagonisten mit verbesserten pharmakologischen Eigenschaften nützlich sein.